Ilościowe obrazowanie sygnałów zależnych od receptorów Toll podobnych specyficznych dla linii komórkowych w monocytach i komórkach dendrytycznych z niewielkich próbek ludzkiej krwi

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zademonstrowanie wykorzystania technologii analizy strumieni obrazów do ilościowego określania mechanizmów komórkowych pierwotnych komórek odpornościowych pochodzących z dobrze zdefiniowanych kohort pacjentów. Osiąga się to poprzez wstępną izolację mononuklearnych komórek krwi obwodowej lub pbmc z próbek krwi pobranych od pacjentów lub zdrowych ochotników. Po izolacji komórki są aktywowane, a następnie znakowane fluorescencyjnie.

Następnie komórki są ogniskowane hydrodynamicznie, wzbudzane światłem laserowym i obrazowane przy użyciu integracji z opóźnieniem czasowym (TDI). Wykorzystywana jest kamera CCD. Na koniec, przy użyciu cytometru strumieniowego obrazów, pozyskiwane są obrazy oraz przeprowadzana jest kwantyfikacja NF kappa b.

Translokację w każdym obrazie komórkowym wykonuje się przy użyciu oprogramowania ideas. Ostatecznie różnice między poszczególnymi grupami badawczymi można określić poprzez analizę wykresów kropkowych, histogramów oraz obrazów komórek. Zaletą strumieniowania obrazów jest połączenie danych faktograficznych z immunofluorescencją.

Jesteśmy w stanie badać szlaki sygnalizacyjne komórek w sposób specyficzny dla danej linii komórkowej, zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji, zaczynając od niewielkiej próbki krwi. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania badawcze poprzez lokalizację i kwantyfikację pośredników sygnalizacji. Można ją na przykład wykorzystać do badania mediowanej translokacji jądrowej czynników transkrypcyjnych lub do analizy wpływu starzenia się na biologię komórki.

Pracownik mojego laboratorium zaprezentuje technikę po wyizolowaniu monocytów krwi obwodowej otrzymanych od ochotników. Resuspender odzyskane PBMC w stężeniu 3 × 10⁶ komórek na 0,6 ml pożywki, a następnie przenieść zawiesinę komórkową do probówek o pojemności 1,5 ml. Następnie część komórek należy stymulować agentem aktywującym, takim jak TLR8 agonistą R848 pokazanym tutaj, a potem inkubować wszystkie komórki w temperaturze 37°C przez 10–60 minut w inkubatorze z 5% CO2.

Po okresie inkubacji odwiruj komórki przez pięć minut przy 500 ×g w temperaturze pokojowej, odlej supernatant, a następnie znakuj komórki koktajlem przeciwciał powierzchniowych specyficznych dla linii monocytów lub komórek DC przez 20 minut w temperaturze 4 °C, w tym probówki z komórkami znakowanymi pojedynczymi koniugatami barwnymi, które posłużą jako kontrole kompensacji. Następnie utrwal komórki w 4% PFA w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu komórek przez 10 minut przy 500 ×g w temperaturze pokojowej, resuspenduj PBMC w buforze do mrożenia i przechowuj komórki w temperaturze -80 °C do dnia przeprowadzenia analizy w ramach testu.

Szybko rozmroź komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie, po odwirowaniu w celu usunięcia buforu do mrożenia, poddaj je permeabilizacji za pomocą 100 µL buforu do płukania i permeabilizacji BD perm. Następnie inkubuj je z przeciwciałami przeciwko wewnątrzkomórkowym komponentom sygnalizacyjnym, takimi jak przeciwciała anty-NF kappa BP 65 pokazane tutaj, przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu i zebraniu komórek w pellet, resuspenduj je w 100 µL buforu do płukania i permeabilizacji BD perm zawierającego przeciwciała kozie anty-rabbit IgG.

Alexa 6 47 i inkubować PBMC przez kolejne 20 minut w temperaturze pokojowej. Bezpośrednio przed obrazowaniem przeprowadzić przeciwbarwienie komórek barwnikiem jądrowym; rozpocząć od włączenia ImageStream, a następnie uruchomić oprogramowanie Inspire. Następnie kliknąć „load default template”, a potem wybrać „initialize fluidics”.

Następnie kliknij menu galerii obrazów i wybierz opcję „zaznacz wszystko”. Teraz naciśnij przycisk uruchomienia konfiguracji, aby rozpocząć obrazowanie kulek, a następnie wybierz kanał pola jasnego. Gdy kulki prędkościowe będą w ruchu, kliknij „start all” w zakładce assist, aby skalibrować i przetestować instrument.

Po skalibrowaniu systemu ImageStream należy nacisnąć przycisk flush, lock and load, aby wprowadzić najjaśniejszą próbkę do urządzenia. Następnie należy ustawić moc lasera w taki sposób, aby każdy fluorochrom miał maksymalną wartość piksela między 104 000 counts, zgodnie z pomiarami na wykresach kropkowych. Następnie należy ustawić kryteria klasyfikacji komórek.

Teraz kliknij „run, acquire”, aby zebrać i zapisać plik z danymi eksperymentnymi. Aby przeanalizować pliki z danymi, otwórz najpierw oprogramowanie analityczne. Utwórz skompensowane pliki obrazów, a następnie zastosuj bramkowanie dla zdarzeń o normalnej intensywności barwnika jądrowego i wysokim współczynniku kształtu (aspect ratio) barwnika jądrowego. Aby odróżnić pojedyncze komórki w bramce R1 od debris lub zdarzeń wielokomórkowych, monocyty lokalizuje się w bramce dla komórek CD14-dodatnich; mieloidalne komórki dendrytyczne, które wykazują wysoką ekspresję CD11c oraz niską ekspresję CD4 i markerów lin1, znajdują się w bramce R3.

Na koniec należy użyć oprogramowania IDEAS do określenia kolokalizacji cytoplazmatycznego czynnika transkrypcyjnego NF kappa B z barwnikiem jądrowym. Wysoka korelacja NF kappa B i barwnika jądrowego, wskazująca na kolokalizację obu markerów, przejawia się wysokim wynikiem podobieństwa i określa stopień aktywacji komórki. Procent zdarzeń o wysokim podobieństwie pomiędzy różnymi grupami badawczymi lub populacjami pacjentów można porównać w celu oceny względnej wydajności funkcjonalnej komórek w programie IDEAS.

Następnie można wykorzystać oprogramowanie do wyświetlania obrazów komórek z kluczowych segmentów histogramów populacji. System ImageStream umożliwia bramkowanie podzbiorów komórek bezpośrednio z pbmc oraz obrazowanie odpowiedzi komórkowych z bramkowanych, ale niesortowanych populacji komórek. W niniejszym przypadku określono ilościowo w stanie wyjściowym wpływ sygnalizacji TLR na lokalizację jądrową NF kappa BP 65 w myeloid dcs lin one, negative CD four, dim CD 11 C positive.

Obserwowano wysoki odsetek niepobudzonych komórek z czynnikiem transkrypcyjnym NF kappa BP 65 w cytoplazmie. Po stymulacji ustalono, że komórki poddane działaniu preparatu wykazują znacznie wyższy wynik podobieństwa NF Kappa BP 65 do jądrowego barwnika PI, co wskazuje na translokację NF Kappa BP 65 do jądra komórkowego po stymulacji. Cyfrowe obrazy populacji komórek niepoddanych działaniu czynnika oraz stymulowanych R 8 48, zebrane jednocześnie, przedstawiają reprezentatywne komórki oraz intensywność translokacji NF kappa B do jądra komórkowego. Należy zwrócić uwagę na większą intensywność barwienia NF Kappa B i PI w grupie stymulowanej R 8 48 w porównaniu do komórek niepobudzonych.

Zastosowaliśmy tę technikę w badaniach komórek pochodzących od dawców w różnym wieku, wykazując różnice w szlakach aktywacji NF kappa B pośredniczonych przez TLR. Po opanowaniu tej metody, procedurę można przeprowadzić w ciągu jednego dnia, poza dodatkowym czasem przeznaczonym na analizę obrazów, co pozwala na uzyskanie zarówno wielu obrazów lokalizacji, jak i statystyk populacyjnych. Dodatkowo możemy obrazować odpowiedzi bezpośrednio z wielu populacji komórkowych bez konieczności ich fizycznej separacji. Analiza strumieni obrazów może znaleźć szerokie zastosowanie w badaniu wielu mechanizmów komórkowych i powinna być bardzo wartościowa w badaniach translacyjnych.