Izolacja komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z trójwymiarowej mieszanej kokultury sferoidów komórkowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pozyskanie komórek nabłonkowych z trójwymiarowych mieszanych kultur tkankowych w celu analizy wpływu fibroblastów zrębu na biologię komórek nabłonkowych. Cel ten osiąga się poprzez uprzednie utworzenie trójwymiarowych mieszanych kultur steroidowych. Następnie sferoidy są oddzielane od kultury macierzy w celu wyizolowania komórek nabłonkowych po okresie współhodowli.

Kolejnym krokiem jest pasażowanie komórek nabłonkowych po kokulturze, aż będą one gotowe do analizy. Ostatecznie wpływ ekspozycji na fibroblasty w kulturze trójwymiarowej na zachowanie komórek nabłonkowych można ocenić poprzez obrazowanie mikroskopowe kultur oraz analizę po kokulturze. W przypadku komórek nabłonkowych będą to, jak pokazano tutaj, obrazowanie fluorescencyjne inwazji macierzy oraz migracja w systemie Transwell. Procedurę zademonstruje Quin, pracownik naukowy z mojego laboratorium, który dzień wcześniej przygotował kokultury.

Wyjmij Matrigel z zamrażarki i rozmrażaj go przez noc na lodzie w lodówce o temperaturze 4 °C. W dniu eksperymentu umieść pożywkę hodowlaną na lodzie co najmniej na jedną godzinę przed zmieszaniem jej z Matrigelem. Aby rozcieńczyć rozmrożony Matrigel.

Do sterylnej probówki umieszczonej na lodzie dodaj połowę objętości lodowatego medium H Mac niezbędnej do kokultury. Następnie, utrzymując probówkę na lodzie, dodaj do niej taką samą połowę całkowitej objętości rozmrożonego matrigelu, aby uzyskać rozcieńczenie jeden do jednego. Następnie nanieś 50 µL mieszaniny medium z matrigelem na środek odpowiednich studni płytki 24-dołkowej i inkubuj płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z nawilżonym powietrzem i 5% CO2 przez 10 minut.

Następnie należy dodać do dołków dodatkowe 450 µL mieszaniny pożywki z Matrigel i inkubować przez kolejne 60 minut. Podczas drugiej inkubacji przygotuj zawiesinę fibroblastów i komórek nabłonkowych w stosunku jeden do jednego, w stężeniu 0,5 × 10⁵ komórek w każdym 0,5 ml pożywki HM. Po zestaleniu się mieszaniny pożywki z Matrigel, ostrożnie nanieś zawiesinę komórkową na powierzchnię żelu i przenieś hodowlę z powrotem do inkubatora na dwa dni.

Wymieniaj pożywkę co dwa do trzech dni, bardzo ostrożnie odsysając ją z boku studni i delikatnie zastępując świeżą pożywką HEC; codziennie monitoruj formowanie się sferoidów pod mikroskopem, wykonując w razie potrzeby zdjęcia za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej. Rozpocznij od dziesięciokrotnego pipetowania hodowli w górę i w dół za pomocą sterylnej szklanej pipety o pojemności 2 ml. Następnie przenieś hodowlę szklaną pipetą do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wiruj przez 10 minut przy 350 ×g w temperaturze pokojowej; po wirowaniu sferoidy komórkowe osadzą się na dnie probówki.

Używając sterylnej końcówki pipety Pasteura, ostrożnie usuń rozbitą żelatynę Matrigel z powierzchni wirówki. Przygotowanie. Następnie dodaj 1 mL medium H mac do osadu, pipetując go w górę i w dół dwa lub trzy razy za pomocą sterylnej szklanej pipety o pojemności 2 mL, a następnie przenieś hodowlę do dołka w 24-dołkowej płytce do hodowli tkanek. Pozostaw steroidy do przytwierdzenia się do płytki przez co najmniej 48 godzin przed wymianą medium.

Z czasem komórki opuszczą strukturę sferoidalną i zaczną rosnąć jako monowarstwy; po osiągnięciu przez hodowle komórkowe 50% konfluencji należy je przepasażować zgodnie ze standardowym protokołem do naczynia o średnicy 35 mm na okres od dwóch do czterech dni, a następnie do naczynia o średnicy 100 mm na okres od trzech do pięciu dni przed przystąpieniem do dalszej analizy komórek. Użyj sterylnej pipety Pasteura, aby odessać medium, a następnie ręcznie usuń jak najwięcej pozostałych sferoidów. W trójwymiarowych kokulturach sferoidalnych fibroblasty z wyciszeniem TM1, jak pokazano tutaj na rysunkach D, E i F, indukują zwiększoną inwazję macierzy przez komórki nabłonkowe gruczołu piersiowego w porównaniu z fibroblastami kontrolnymi na rysunkach A, B i C. Zwróć uwagę na wypustki nabłonkowe naciekające macierz w sferoidach zawierających fibroblasty z wyciszonym TM1, wskazane strzałkami na rysunkach D i F. Fibroblasty z nadekspresją TM1, pokazane tutaj na rysunkach J, K i L, indukowały zmniejszoną inwazję linii komórkowej raka piersi SUM159 w porównaniu z fibroblastami kontrolnymi na rysunkach G, H i I; porównaj brak wypustek nabłonkowych w sferoidach zawierających fibroblasty z nadekspresją TM1 z tymi zawierającymi fibroblasty kontrolne, wskazane strzałkami na rysunkach G i I, po ustaleniu sferoidów kokulturowych.

Populacje komórek można izolować ze steroidów poprzez ponowne wysianie w kontekście dwuwymiarowym. Ten kompozyt obrazów przedstawia hodowle w mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej po ich izolacji z hodowli w matrigelu. Dzień zero oznacza obrazowanie bezpośrednio po izolacji, natomiast dni pierwszy, drugi i piąty wskazują liczbę dni po izolacji.

Zauważ, jak korona komórek opuszczających ten steroid powiększa się z czasem. Ostatecznie pozostaje „steryd-duch” z niewielką liczbą komórek, co zaznaczono tutaj strzałką. Po usunięciu „duchów” i pasażowaniu pozostaje bardzo niewiele steroidów.

Zależnie od względnych tempo wzrostu badanych komórek, populacje czyste mogą powstać w wyniku seryjnych pasażów lub mogą zostać wyselekcjonowane przy użyciu odpowiednich markerów komórkowych. W tym przykładzie próbki są analizowane metodą cytometrii przepływowej, wykorzystując fluorescencję zieloną i czerwoną odpowiednio do identyfikacji fibroblastów wykazujących ekspresję GFP oraz komórek nabłonkowych wykazujących ekspresję mCherry, aby określić względne liczebności populacji komórek nabłonkowych i fibroblastów.

Po izolacji z hodowli 3D w układzie kokultury, komórki nabłonkowe zachowują właściwości nadane przez kokulturę z fibroblastami przez dłuższy czas, co stwarza szerokie możliwości prowadzenia analiz. W tym przykładzie ekspozycja na fibroblasty z niedoborem TM one indukowala zwiększoną migrację w kokulturowanych komórkach H max, która utrzymywała się przez wiele tygodni po izolacji z kokultury 3D w porównaniu z ekspozycją na fibroblasty kontrolne, oznaczone tutaj jako C po zastosowaniu tej procedury. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące wpływu fibroblastów na komórki nabłonkowe można zastosować inne metody, takie jak analiza zmian w ekspresji genów i znaczników epigenetycznych.