TransFLP — Metoda genetycznej modyfikacji Vibrio cholerae oparta na naturalnej transformacji i rekombinacji FLP

Celem niniejszej procedury jest manipulacja genetyczna vio cray przy użyciu tej szybkiej i wydajnej metody, opartej na naturalnej transformacji i kombinacji flip. Jest to realizowane poprzez przygotowanie w pierwszym kroku odpowiedniego źródła chityny, ponieważ chityna jest naturalnym induktorem transformacji. W drugim kroku generowany jest konstrukt DNA przy użyciu dwóch rund PCR, a następnie przeprowadzana jest transformacja naturalna, co pozwala bakteriom zawierającym plazmid PBR flip na pobranie fragmentu PCR i włączenie go do ich genomów.

Następnie stosuje się podwyższenie temperatury w celu indukcji enzymu lipazy kodowanego przez plazmid, co prowadzi do usunięcia kasety oporności na antybiotyki flankowanej przez miejsce docelowe rekombinacji flip (FRT). W ostatnim kroku bakterie są oczyszczane z plazmidu kodującego FLP. Ostatecznie, za pomocą PCR i sekwencjonowania wykazuje się, że manipulacja genetyczna zakończyła się sukcesem.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie plazmidów samobójczych do manipulacji genetycznej vire, jest jej szybkość i wydajność. Należy rozpocząć od odważenia próbek płatków chityny o masie od 50 do 80 mg do standardowych probówek plastikowych o pojemności 1,5 ml, a następnie, pozostawiając nakrętki probówek otwarte, poddać płatki autoklawowaniu. Natychmiast po zakończeniu cyklu autoklawowania należy zamknąć nakrętki i przechowywać zestaw z płatkami w temperaturze pokojowej. Do amplifikacji za pomocą PCR wybranych regionów DNA, a także flankowanej sekwencjami FRT kasety antybiotykowej, wymagane są co najmniej sześć oligonucleotides. Zaleca się również dołączenie pary starterów oligonucleotides poza wstawionym fragmentem PCR.

Pozwala to na sprawdzenie integracji oraz prawidłowego wycięcia kasety oporności na antybiotyki flankowanej sekwencjami FRT; należy z uwagą dobrać oligonukleotydy numer dwa, trzy, cztery i pięć. Primery dwa i pięć powinny składać się z co najmniej 28 par zasad, aby umożliwić wystarczające przyłączenie do DNA genomowego, natomiast primery trzy i cztery powinny zostać zaprojektowane z wykorzystaniem plazmidu zawierającego sekwencję FRT w roli matrycy. Primery dwa i pięć należy zaprojektować tak, aby umożliwić rozległe komplementarne parowanie zasad na końcu 5' odpowiednio między primerem dwa a trzy oraz między primerem cztery a pięć.

W pierwszej rundzie PCR należy wykorzystać oligonukleotydy pierwszy i drugi do przygotowania pierwszej z trzech jednoczesnych, lecz niezależnych reakcji PCR w celu amplifikacji regionu powyżej (upstream) badanej sekwencji w specjalnie zaprojektowanych konstruktach. Równolegle należy przygotować drugą reakcję PCR, wykorzystując oligonukleotydy trzeci i czwarty, aby amplifikować kasetę antybiotykową flankowaną sekwencjami FRT. W niniejszym doświadczeniu wykorzystano na przykład gen A PH kodujący oporność na kanamycynę.

Jednocześnie przeprowadź amplifikację regionu DNA położonego w kierunku 3', przygotowując trzecią reakcję PCR z wykorzystaniem oligonukleotydów pięć i sześć oraz genomowego DNA jako matrycy. Następnie rozpocznij reakcję PCR dla wszystkich trzech próbek. Po oczyszczeniu wszystkich trzech fragmentów PCR użyj mieszaniny zawierającej równe ilości wszystkich trzech fragmentów uzyskanych w pierwszej rundzie jako matrycy do przeprowadzenia drugiej rundy PCR. Amplifikacja ta zostanie skatalizowana przez oligonukleotydy jeden i sześć.

Otrzymany fragment PCR będzie służył jako transformujące DNA w eksperymentach dotyczących transformacji naturalnej. Po wyhodowaniu komórek v cholera w medium wzbogaconym tlenowo w temperaturze 30 °C, należy zebrać bakterie poprzez wirowanie w temperaturze pokojowej.

Następnie przenieś kulturę bakteryjną na chitynowe płatki i inkubuj zawiesinę komórek przez noc w temperaturze 30 °C. Następnie ostrożnie wymieszaj co najmniej 200 ng fragmentów pochodzących z drugiej rundy PCR z zawiesiną komórek bakteryjnych. Dbając o to, aby nie odrywać nadmiernie bakterii od powierzchni chityny, inkubuj ten roztwór w temperaturze 30 °C bez ruchu przez kolejny dzień.

Następnie energicznie mieszaj kulturę w wirówce typu vortex przez co najmniej 30 s. Dla bakterii zawierających plazmid PBR flip nanieś 100 do 300 µL roztworu komórek na podwójnie selektywne płytki zawierające ampicylinę oraz drugi antybiotyk. Inkubuj kultury komórek bakteryjnych w temperaturze 30 °C do momentu pojawienia się widocznych kolonii. Następnie wyizoluj pojedyncze transformanty z płytek selektywnych.

Krok ten rozpocznij od hodowli bakterii na płytkach z agarem LB zawierającym ampicylinę w temperaturze 37°C przez 16 do 24 godzin. W ramach opcjonalnego etapu można zmienić temperaturę na 40°C na dwie do trzech godzin, ponieważ ekspresja flip z plazmidu PBR flip jest derepresowana w wyższych temperaturach. Po kolejnych ośmiu godzinach inkubacji w 37°C przenieś bakterie na świeże płytki.

Następnie ogranicz klony równolegle na płytkach agarowych z antybiotykiem i bez antybiotyku, aby przetestować ich wrażliwość na antybiotyk, a następnie wyizoluj pojedynczą powstałą kolonię wrażliwą na antybiotyk. Rozpocznij ten etap od hodowli kultury przez noc w warunkach tlenowych w temperaturze 30 °C w pożywce wzbogaconej bez antybiotyków. Następnego ranka wyhoduj nową kulturę przez trzy do sześciu godzin, rozcieńczając kulturę nocną w stosunku 1:100 w świeżej pożywce bez antybiotyków; po południu wysiej rozcieńczoną kulturę na zwykłe płytki z agarem LB, a następnie inkubuj płytki przez kolejne 8 do 16 godzin w temperaturze 30 °C, aż kolonie staną się widoczne.

W tym pierwszym eksperymencie celem było usunięcie sąsiednich genów CTXA i CTXB. Oligonukleotydy do metody trans flip wygenerowano zgodnie z wcześniejszą prezentacją; przetestowano genotyp szczepu rodzicielskiego, szczepu pośredniego zawierającego flankowaną sekwencjami FRT kasetę oporności na antybiotyk zamiast oryginalnego locus DNA C-T-X-A-B oraz szczepu końcowego z delecją C-T-X-A-B, wolnego od kasety oporności. W tym celu przeprowadzono analizę PCR całego genomu, stosując primery, które nie wiązały się z transformującym fragmentem PCR, lecz wyłącznie z DNA chromosomalnym. Fragmenty PCR rozdzielono za pomocą standardowej elektroforezy w żelu agarozowym w celu określenia ich wielkości.

W pierwszej ścieżce szczep cholery typu B z całego świata znajdował się na oczekiwanym rozmiarze fragmentu 3 143 par zasad. W drugiej ścieżce fragment PCR pochodzący ze szczepu delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT znajdował się na poziomie 3 162 par zasad.

W ścieżce trzeciej fragment delta ctx A B FFR TP CR znajdował się na poziomie 1 769 par zasad w odniesieniu do drabinki 1 KB. W drugim przykładzie, w którym usunięto całą wyspę genomiczną, jako cel eksperymentu wybrano wyspę patogenności Vibrio jeden lub VPI one. Metodę trans flip zmodyfikowano w dwóch krokach.

Najpierw integrację genu oporności na kanamycynę poprzedzono wprowadzeniem pojedynczej sekwencji FRT na początku wyspy patogenności (PI) jednej. Następnie przeprowadzono drugą rundę transformacji naturalnej, co pozwoliło na wprowadzenie dodatkowego markera oporności na antybiotyk, a mianowicie oporności na gentamycynę, za którą następowała druga sekwencja FRT na końcu wyspy patogenności. Odpowiednie pary starterów są wskazane nad każdym zdjęciem żelu, a metodę trans FLP kontynuowano zgodnie z powyższym opisem.

Szczepy rodzicielskie, pośrednie i końcowe zostały zweryfikowane za pomocą PCR oczyszczonego DNA genomowego w ścieżce pierwszej. W ścieżce drugiej naniesiono fragment PCR szczepu V cholera typu dzikiego. Naniesiono również fragment PCR otrzymany ze szczepu VPI one FRT can GM FRT.

W ścieżce trzeciej przeanalizowano produkt PCR pochodzący ze szczepu delta VPI one FRT. Pary starterów są wskazane nad każdym zdjęciem żelu. W końcowym szczepie brakuje całego VPI one.

W tym trzecim przykładzie sekwencja promotora zależnego od polimerazy RNA T7 została zintegrowana powyżej genu Tfox, głównego regulatora naturalnej transformacji, przy użyciu metody trans flip z niewielką modyfikacją standardowego protokołu. Konsensusowa sekwencja promotora zależnego od RNA T7 została wprowadzona jako nawisy w oligonukleotydach numer cztery i pięć, tak aby ta sekwencja DNA została zachowana w chromosomie. Nawet po wycięciu kasety oporności na antybiotyki, konstrukt został następnie zintegrowany w szczepie V colorized zawierającym polimerazę RNA T7.

W tym szczepie ekspresja genu polimerazy RNA T7 była sterowana przez promotor LAC UV5, aby przetestować zależną od polimerazy RNA T7 ekspresję T-Fox. Testy transformacji naturalnej przeprowadzono w podłożu LB. Szczep rodzicielski, pozbawiony promotora zależnego od T7 poprzedzającego gen T-Fox, nie wykazuje zdolności do naturalnej transformacji w tych warunkach ze względu na brak transkrypcji T-Fox w podłożu bogatym i w obecności jego naturalnego induktora, chityny. Fenotyp ten był niezależny od tego, czy polimeraza RNA T7 była sztucznie indukowana za pomocą IPTG, czy nie.

Jednakże szczep wygenerowany przez trans-flip, który zawiera promotor zależny od polimerazy RNA T7 powyżej genu kompetencji T Fox, był rzeczywiście naturalnie transformowalny w medium wzbogaconym ze względu na nieszczelność promotora LAC UV5 w medium LB. Wytworzona polimeraza RNA T7 transkrybowała już T FOX z promotora zależnego od polimerazy RNA T7 bez indukcji IPTG. Zainicjowało to naturalną kompetencję i transformację, potwierdzając funkcjonalność zintegrowanej sekwencji promotora zależnego od polimerazy RNA T7.

Fenotyp ten został znacznie nasilony poprzez pełną indukcję polimerazy RNA T7 w wyniku dodania IPTG, będącego induktorem promotora lacUV5. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak modyfikować genetycznie V. cholerae, wykorzystując połączenie naturalnej transformacji indukowanej chityną oraz rekombinacji flip. Po opanowaniu ta technika umożliwia usuwanie genów lub wysp genomowych, a także integrowanie sekwencji DNA w sposób celowany w ciągu zaledwie kilku dni.