Radioaktywna hybrydyzacja in situ w celu wykrywania różnorodnych wzorców ekspresji genów w tkance

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zidentyfikowanie obszarów ekspresji konkretnego genu oraz charakterystyka czasu i poziomów tej ekspresji, aby przyczynić się do zrozumienia funkcji genu. Osiąga się to poprzez szybkie pobranie i przygotowanie tkanki wykorzystywanej w procedurze, co pozwala zachować jej integralność. W drugim kroku tkanka poddawana jest obróbce w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania sond rybo.

Następnie sondy ribo są hybrydyzowane z tkanką, a następnie wizualizuje się wiązanie sondy RIBA. Z wykorzystaniem filmu rentgenowskiego lub emulsji światłoczułej uzyskuje się wyniki wskazujące lokalizację i poziom ekspresji genów na podstawie obrazów rentgenowskich lub analizy mikroskopowej w polu ciemnym i jasnym. Przy użyciu oprogramowania Image J wykonuje się kilka krytycznych kroków, które muszą być przeprowadzone prawidłowo, ponieważ wielu badaczy popełnia w nich błędy; jednym z nich jest zapobieganie powstawaniu tła.

Istnieje szereg czynników, które mogą powodować pojawienie się tła, takich jak niewłaściwa saturacja lub hybrydyzacja w niewłaściwej temperaturze. Kolejnym problemem jest kontaminacja RNazami, które zdegradują sondę RNA. Należy zatem dbać o to, aby wszystkie elementy pozostawały wolne od RNaz.

Po trzecie, podczas zanurzania szkiełek w emulsji należy upewnić się, że w ciemni nie występują żadne wycieki światła ani ekspozycja emulsji na światło na wszystkich etapach tego procesu, który może trwać trzy tygodnie. Technikę tę zaprezentuje Hun Chen, postdoktor w moim laboratorium. Po pobraniu świeżego mózgu i przemyciu go w 1x PBS, należy zatopić mózg w medium OCT tissue tech, zanurzając go w formie zawierającej medium w temperaturze pokojowej.

Należy upewnić się, że mózg jest zorientowany w sposób odpowiedni do sekcjonowania. Następnie, po spryskaniu suchego lodu etanolem, zamrozić tkankę, umieszczając blok w mieszaninie etanolu i suchego lodu. Uważając, aby etanol nie dostał się do wnętrza bloku, przy użyciu kriotomu pociąć zamrożoną tkankę na sekcje o grubości od 10 do 12 mikronów i osadzić je na szkiełkach typu super plus przeznaczonych do tkanek mózgowych i embrionalnych.

Optymalna temperatura cięcia mieści się w zakresie od -18 °C do -20 °C. Przekroje należy przechowywać w pudełku na szkiełka w temperaturze -80 °C. Szkiełka należy przenieść z przechowywania w -80 °C do metalowego statywu na suchym lodzie.

Następnie, pracując w certyfikowanej dygestorium, umieść kasetkę w roztworze 4% paraformaldehydu, który został uprzednio podgrzany do temperatury o trzy do pięciu stopni Celsjusza wyższej od temperatury pokojowej. Inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji wyjmij kasetkę z paraformaldehydu i przemyj preparaty, zanurzając kasetkę w PBS 15 razy. Powtórz ten etap płukania dwukrotnie, używając za każdym razem świeżego roztworu PBS.

Następnie zanurz preparaty w świeżo przygotowanym buforze do acetylacji na 10 minut, aby zredukować nieswoiste wiązanie sondy RIBA. Potem wypłucz preparaty w sposób opisany wcześniej, ale tym razem stosując roztwór SSPE 2× jako płyn do płukania. Odwodnij tkankę, przeprowadzając ją przez serię stężeń etanolu: 70%, 95% i 100%, przez dwie minuty w każdym roztworze.

Następnie wysusz preparaty w dygestorium przez co najmniej 10 do 15 minut. Po syntezie sondy RIBA, zgodnie z instrukcjami w protokole pisemnym, oblicz wymaganą objętość sondy RIBA i roztworu do hybrydyzacji potrzebną dla wszystkich preparatów. Podgrzej mieszaninę do hybrydyzacji sondy Ribo do 65 °C przez pięć minut.

Aby zdenaturować sondę Ribo, nanieś pipetą 100 µL roztworu hybrydyzacyjnego sondy Ribo i rozprowadź go na szkiełku nakrywkowym. Następnie użyj drugiego szkiełka nakrywkowego, aby równomiernie rozprowadzić roztwór na tkance i szkiełku. Umieść preparat poziomo, stroną górną do góry, w metalowym statywie, a gdy wszystkie preparaty będą gotowe, powoli zanurz statyw w kąpieli olejowej o temperaturze 65 °C na minimum cztery godziny i maksymalnie 16 godzin.

Olej tworzy szczelną powłokę wokół szkiełek nakrywkowych po inkubacji tkanek; należy usunąć nadmiar oleju z metalowego statywu zawierającego preparaty. Następnie należy umieścić statyw w szklanej lub metalowej kuwecie z chloroformem, korzystając z dygestorium. Płukanie należy powtórzyć, używając drugiej kuwety ze świeżym chloroformem.

Następnie zanurz statyw w roztworze 0.1% betta me cap etanolu i dwukrotnego roztworu SSPE, aby poluzować szkiełka nakrywki i rozpuścić nadmiar roztworu hybrydyzacyjnego. Następnie przenieś slajdy do drugiego roztworu świeżego 0.1% betta me cap TER etanolu i dwukrotnego roztworu SSPE. Przenieś odsłonięte slajdy do nowego statywu w kuwecie zawierającej 0.1% beta macca TER etanol w dwukrotnym roztworze SSPE i inkubuj w tym roztworze przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar niezwiązanej sondy RNA.

Następnie przenieś kasetę z szkiełkami do podgrzanego do 65°C roztworu 2×SSPE z dodatkiem 50% formamidu jako głównego roztworu do denaturacji, zawierającego β-ME i etanol w stężeniu końcowym 0,1%, i inkubuj w temperaturze 65°C przez jedną godzinę. Po inkubacji zutylizuj ten oraz wszystkie poprzednie wodne roztwory płuczące, a także szkiełka zakrywkowe jako odpady promieniotwórcze. Następnie przemyj szkiełka dwukrotnie w podgrzanym do 65°C roztworze 0,1×SSPE, inkubując przez 30 minut po każdym razie.

Następnie odwodnij tkankę, przeprowadzając ją przez serię roztworów etanolu 70%, 95% i 100% przez dwie minuty w każdym roztworze. Na koniec wysusz preparaty w dygestorium przez co najmniej 30 minut. W pierwszej kolejności należy ustalić, czy w tkance występuje sygnał radiacyjny.

Umieścić wysuszone preparaty w kasecie do zdjęć, pracując w ciemni przy świetle bezpiecznym, a następnie nałożyć folię rentgenowską na preparaty. Upewnić się, że preparaty są skierowane stroną emulsji folii, a następnie zamknąć kasetę. Naświetlać folię preparatami od jednego do siedmiu dni, w zależności od spodziewanej liczby transkryptów.

Po zakończeniu naświetlania należy wywołać film rentgenowski w standardowym wywoływaczu i utrwalaczu. Sygnał hybrydyzacji pojawi się na filmie w postaci czarnych obszarów wynikających z naświetlenia ziaren srebra w emulsji, co pozwala na określenie rozdzielczości komórkowej i zaobserwowanie sygnału bezpośrednio w tkance. Preparaty na szkiełkach są zanurzane w emulsji fotograficznej, a następnie poddawane barwieniu kontrastowemu.

Jeśli preparaty mają zostać poddane barwieniu kontrastowym fioletem krystalicznym, należy przeprowadzić delikatną delipidację przekrojów zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym. Następnie, pracując w ciemni, należy nalać wodę destylowaną do probówki. Nabrać emulsję NTB i rozcieńczyć ją wodą destylowaną w stosunku jeden do jednego.

Po roztopieniu emulsji w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C przez 20 do 30 minut, przelej ją do szklanego naczynia do zanurzania w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C przez 20 do 30 minut. Poziom rozcieńczonej emulsji powinien teraz pokrywać wszystkie przekroje na preparacie podczas jego zanurzania. W przypadku dużej liczby preparatów może być konieczne użycie dodatkowej emulsji.

Następnie zanurz preparaty w rozcieńczonej emulsji w kąpieli wodnej o temperaturze 42°C, a następnie wysusz je w zamkniętym, światłoszczelnym pojemniku przez noc w ciemni lub w inkubatorze w temperaturze 37°C przez dwie do trzech godzin przy wyłączonym oświetleniu. Po wysuszeniu przenieś preparaty do kasetki. Oklej krawędzie czarną taśmą izolacyjną, a następnie owiń całość folią aluminiową.

Przechowywać kasety w temperaturze 4°C przez okres od kilku dni do kilku tygodni; przed przystąpieniem do wywoływania ogrzać preparaty do temperatury pokojowej. Następnie, pracując w ciemni, wyjąć ramkę z preparatami z kaset i wywoływać je w wywoływaczu codec D 19 w temperaturze 16°C przez 3 do 5 minut. Następnie wypłukać wywołane preparaty w wodzie z kranu w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.

Następnie inkubuj preparaty dwukrotnie w roztworze utrwalającym w temperaturze 19 °C po sześć minut za każdym razem; podczas drugiej inkubacji w utrwalaczu można zapalić światło w pomieszczeniu. Teraz przemyj preparaty w bieżącej wodzie o temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Następnie, używając żyletki, zeskrob emulsję z tyłu szkiełka, gdy jest ono jeszcze mokre.

Na koniec przeprowadź przeciwbarwienie 0,3% fioletem krystalicznym, a następnie, jeśli jest to konieczne, odwodnij i zamontuj preparaty zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym. Usuń nadmiar emulsji z rewersu szkiełek, zwilżając je wodą i skrobiąc żyletką. Przepłucz szkiełka w 80% roztworze etanolu i przetrzyj delikatnie jeden lub dwa razy, aby usunąć zanieczyszczenia i kurz.

Wykonaj zdjęcia przy oświetleniu w ciemnym polu lub jasnym polu. Kroki skrobania i czyszczenia mogą wymagać powtórzenia dwa lub trzy razy, aby uzyskać wysokiej jakości obrazy bez cząsteczek kurzu, które są łatwo widoczne w ciemnym polu pod mikroskopem stereoskopowym. Poniższe obrazy są przykładami autoradiografii hybrydyzacji in situ z filmów rentgenowskich.

Ten obraz z filmu rentgenowskiego przedstawia strzałkowy przekrój całej głowy ptaka śpiewaka z gatunku zebra finch w 10. dniu embrionalnym, który został poddany hybrydyzacji z antysensowną sondą ribo do Fox P one. Czarne ziarna na filmie wskazują ekspresję mRNA, co widać w obrębie mózgu; mRNA Fox P one jest tutaj wzbogacone w meso alium stri aum oraz grzbietowym wzgórzu. Obraz z filmu rentgenowskiego przedstawia przekrój z tego samego ptaka zebra finch, który został poddany hybrydyzacji z sondą 90 cents RIBA do Cuper.

TF two Co.TF two wykazuje wzbogacenie w obszarze palam alium oraz w bardziej brzusznych częściach wzgórza. Poniższe obrazy są przykładami autoradiografii hybrydyzacji in situ z preparatów z emulsją. Ten obraz w ciemnym polu, wykonany pod mikroskopem sekcyjnym, przedstawia cały przekrój strzałkowy głowy ziśpiewki w szóstym dniu po wykluciu, który został poddany hybrydyzacji z antysensowną sondą RIBA przeciwko Fox P one.

Białe, wyeksponowane ziarna srebra w emulsji nad tkanką wskazują ekspresję mRNA. Kolor czerwony reprezentuje barwienie fioletem krezolowym. Pasek skali odpowiada jednej milimetrowi.

Na obrazku przedstawiono przekrój tego samego zięby (zebra finch), u którego przeprowadzono hybrydyzację z antysensowną sondą rybową przeciwko coop TF two. Kolejne obrazy porównują znakowanie antysensowne i sensowne, co ukazuje różne wzory widoczne w autoradiografii na kliszach rentgenowskich przekrojów głowy zięby pobranych w 12. dniu embrionalnym. Linia przerywana wskazuje kontur całego mózgu, a litera C oznacza móżdżek.

Można zauważyć, że nić antysensowna genu PAC six wykazuje ekspresję w mózgu, szczególnie w strefie komorowej. Sąsiedni przekrój zhybrydyzowany z nicią sensowną genu PAC six nie wykazuje ekspresji tła w obrębie głowy embrionu, lecz wyraźną ekspresję w warstwie pigmentowej siatkówki, analogicznie do nici antysensownej. Poniższe obrazy przedstawiają w C dwa sygnały ekspresji genu oraz preparaty z emulsją pobrane z mózgu kanarka w późnych etapach embrionalnych w widoku jasnego i ciemnego pola.

To zdjęcie w jasnym polu pokazuje ekspresję D one B w 10. dniu embrionalnym. Przy normalnej ekspozycji na emulsję etykieta, która wydaje się czarna, jest ledwo widoczna przy tym powiększeniu. To zdjęcie przedstawia identyczny przekrój i powiększenie jak na poprzednim obrazie, ale w widoku ciemnego pola, wykazując białe znakowanie w prążkowiu i wzgórzu.

Ten obraz w jasnym polu przedstawia ekspresję slit3 w 12. dniu embrionalnym. Po nadmiernej ekspozycji emulsji wyraźnie widoczna jest czarna etykieta. SC oznacza położenie rdzenia kręgowego, a CB oznacza położenie móżdżku.

Kierunek rostralny znajduje się po lewej stronie. Przedstawiony tutaj obraz to ten sam przekrój i powiększenie, jednak w widoku w ciemnym polu, ukazującym białe znakowanie w rdzeniu kręgowym, które odpowiada obrazowi w jasnym polu. Kolejne obrazy pokazują rozdzielczość ziaren srebra na poziomie komórkowym.

Przedstawiono tutaj znakowanie mRNA Fox P1 w przedmózgowiu zięby dwukolorowej; ziarna srebra widoczne są jako czarne punkty nad komórkami barwionymi fioletem krystalicznym. Ten obraz wykazuje wysoką ekspresję w poszczególnych komórkach mesoalium u dorosłej zięby dwukolorowej. Ten obraz wykazuje niską ekspresję w poszczególnych komórkach sąsiedniego alium na tym samym przekroju.

Ekspresja mRNA dla Hi Fox P1 jest widoczna w komórkach mezalium w 12. dniu embrionalnym.

Komórki embrionalne widoczne tutaj są mniejsze i bardziej ściśle upakowane w porównaniu z komórkami dorosłymi widocznymi na dwóch poprzednich obrazach. Wreszcie, ten obraz przedstawia niską ekspresję w komórkach sąsiadującego alium tego samego przekroju. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak immunohistochemia, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład w jakim typie komórek ekspresowany jest gen docelowy.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania hybrydyzacji in situ. Należy pamiętać, że praca z odczynnikami promieniotwórczymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie środków ochrony osobistej.