Test zawieszenia ogona
28 stycznia 2012
Test zawieszenia za ogon jest walidowaną procedurą eksperymentalną służącą do oceny skuteczności przeciwdepresyjnej leków u myszy. Myszy są zawieszane za ogony na sześć minut, a następnie ocenia się zachowania związane z próbą ucieczki. Opisujemy procedury stosowane podczas przeprowadzania testu zawieszenia za ogon.
Test zawieszenia za ogon jest powszechnie stosowanym testem behawioralnym wykorzystywanym do przewidywania skuteczności przeciwdepresyjnej różnych manipulacji eksperymentalnych. Film ten prezentuje procedury tego testu. Test zawieszenia za ogon został zwalidowany dla myszy i nie jest zalecany dla większych gryzoni.
W teście zawieszenia za ogon myszy są zawieszane za ogony. Mysz pozostaje w zawieszeniu przez sześć minut. W tym czasie rejestrowane są zachowania osobnika.
Po zakończeniu sześciominutowego okresu testowego taśmę usuwa się z ogona obiektu badanego. Po przeprowadzeniu testu nagrania wideo są przesyłane do komputera lub monitora wideo. Do analizy obserwator mierzy czas, jaki mysz spędza na zmaganiach podczas całej sześciominutowej sesji.
Związki o właściwościach przeciwdepresyjnych zwiększają czas, jaki myszy spędzają na próbach uwolnienia się. Odzwierciedlają to krótsze okresy znieruchomienia. Na przykład donosiliśmy, że lit, lek stabilizujący nastrój, który jest klinicznie przydatny jako pomocniczy lek przeciwdepresyjny, zmniejszył czas znieruchomienia w teście zawieszenia za ogon.
Witajcie, nazywam się Sean i pracuję w laboratorium dr. Todd Goulda w Katedrze Psychiatrii na Uniwersytecie Medycznym w Maryland w Baltimore. Cześć, jestem Chantel z tego samego laboratorium. W tym filmie pokażemy Państwu, jak przeprowadzić i ocenić test zawieszenia za ogon.
Test zawieszenia za ogon jest stosowany do oceny potencjalnej skuteczności leków przeciwdepresyjnych. Przejdźmy zatem do laboratorium, aby pokazać, jak przeprowadzić ten eksperyment. Choć nie jest to wymagane, używamy specjalnie zaprojektowanej skrzynki do zawieszenia za ogon.
Do tego testu wykorzystujemy pudełko do zawieszenia ogona podzielone na cztery przedziały, z których każdy jest przeznaczony dla jednej myszy. Przegrody uniemożliwiają myszom wzajemną obserwację podczas testu.
Można jednak wykorzystać półkę lub inną konstrukcję do zawieszenia myszy. Wymiary pudełka do testu zawieszenia za ogon są dobrane tak, aby zapobiec możliwości sięgania przez myszy i chwytania się krawędzi. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy wyciąć odpowiednią liczbę fragmentów taśmy i zaznaczyć odcinek, który będzie służył do przyklejenia do ogona.
W naszym laboratorium będziemy używać 17 centymetrowych fragmentów taśmy. Należy zaznaczyć dwa centymetry od końca tego fragmentu taśmy, które posłużą do przymocowania go do ogona. Ogon umieszczamy na środku tej dwucentymetrowej części.
Ustaw pudełko do testu zawieszenia za ogon oraz kamerę wideo. Przed wprowadzeniem zwierząt pudełko należy dokładnie wyczyścić roztworem sterylizującym w celu neutralizacji zapachów pozostawionych przez poprzednie osobniki. W naszym laboratorium używamy dwóch różnych pudełek do zawieszenia za ogon, identycznych pod każdym względem z wyjątkiem koloru.
W przypadku myszy albinosów ciemnoszary pojemnik zapewnia dobry kontrast dla nagrań wideo. Dla szczepów myszy o ciemniejszym ubarwieniu odpowiedni będzie biały pojemnik. Włącz generator szumów białych.
Powinno to maskować wszelkie przerywane dźwięki. Przenieść myszy do pomieszczenia zabiegowego w celu aklimatyzacji. Warunki w pomieszczeniu powinny być stałe, wolne od hałasów, zmian poziomu oświetlenia i innych możliwych zakłóceń.
Okres ten trwa zazwyczaj co najmniej godzinę. Po zakończeniu okresu aklimatyzacji można przystąpić do testu, aby zapobiec wspinaniu się niektórych szczepów myszy po własnych ogonach. Podczas testu zawieszenia ogona stosujemy plastikowe cylindry, które umieszczamy nad ogonami.
Walce te spoczywają u podstawy ogona podczas testu. W naszym laboratorium stosujemy plastikowe walce o długości 4 cm i średnicy 1 cm, o masie 1,5 g. Jeśli w celu zapobiegania wspinaniu się używane są plastikowe walce, należy je umieścić na ogonach przed nałożeniem taśmy.
Naklejamy taśmę na sam koniec ogona, pozostawiając dwa do trzech milimetrów ogona poza obszarem zaklejenia. Taśmę mocujemy do ogonów myszy w ich klatkach domowych. Należy użyć zaznaczonego końca taśmy i upewnić się, że przylega ona do ogona oraz do samej siebie.
Po naklejeniu taśmy należy przymocować każdą mysz do ścianek klatki, aby zapobiec splątaniu się taśm przymocowanych do różnych zwierząt. Proces ten należy przeprowadzić szybko, w przeciwnym razie myszy zostaną poddane niepotrzebnemu stresowi.
Nagrywanie należy rozpocząć przed zawieszeniem zwierząt. Zawieś zwierzęta, umieszczając wolny koniec taśmy na pręcie zawieszenia w kolejności zrównoważonej między grupami badawczymi i w sposób, który nie zasłania widoku kamery. Ponieważ myszy są zawieszane jedna po drugiej, każde zwierzę ma nieco inny czas rozpoczęcia testu.
Należy upewnić się, że ocena każdego myszy rozpoczyna się dokładnie w momencie rozpoczęcia okresu zawieszenia. Ważne jest, aby nie zasłaniać widoku kamery. Ponieważ cała sesja zawieszenia ogona będzie oceniana, zasłonięcie widoku kamery mogłoby doprowadzić do utraty danych.
Należy upewnić się, że wszystkie końce taśm są prostopadłe do poprzeczki zawieszenia i mają taką samą długość luzu. Dla każdego osobnika należy uruchomić stoper. Test zawieszenia za ogon trwa sześć minut.
Po upływie sześciominutowego okresu testowego należy zdjąć taśmę z końca każdego ogona i przenieść myszy z powrotem do ich klatki domowej. Na koniec testu należy zarejestrować wideo informacje o osobnikach. Po powrocie myszy do pomieszczenia dla kolonii, pudełko testowe należy dokładnie wyczyścić i przemyć roztworem sterylizującym.
Po zakończeniu testowania omówimy punktację zachowań. Jedyną zmienną zazwyczaj ocenianą podczas punktacji testu zawieszenia za ogon jest czas, w którym zwierzęta pozostają w bezruchu. Aby uzyskać czas immobility, zmierzymy czas, w którym myszy są mobilne, a następnie odejmiemy go od sześciominutowego czasu trwania testu. Będziemy punktować pełne sześć minut testu.
W pierwszej kolejności zakrywamy myszy, które nie są aktualnie oceniane, aby obserwator mógł skupić się tylko na jednym zwierzęciu w czasie przeznaczonym dla każdej myszy. Mobilność jest mierzona za pomocą stoperów wyświetlanych na ekranie, sterowanych za pomocą kontrolera gier. Tutaj, jak widać, znajdują się dwa oddzielne stopery ekranowe, które są sterowane jednocześnie.
Pierwszy stoper odlicza czas od 360 sekund, wskazując obserwatorowi czas trwania testu. Drugi stoper mierzy czas, w którym badane osobniki pozostają mobilne. Jak można zauważyć, drugi stoper jest przesłonięty przez pierwszy, a obserwatorowi widoczne są jedynie jego części milisekundowe.
W ten sposób obserwator będzie mógł sprawdzić, czy stoper odlicza czas, ale nie zobaczy całkowitego czasu mobilności aż do zakończenia oceny. Robimy to, aby zapobiec wpływowi błędu obserwatora na wyniki. Myszy, szczególnie na początku sesji, wykazują zachowania związane z próbą ucieczki.
Zachowania te obejmują próby dotarcia do ścian aparatury oraz pręta zawieszenia, silne wstrząsy ciała i ruchy kończyn przypominające bieg. Ruchy te jednoznacznie stanowią przejaw mobilności. Jednak w miarę trwania testu ruchy stają się bardziej subtelne.
W naszym laboratorium nie uznajemy za mobilność niewielkich ruchów ograniczonych do przednich kończyn, którym nie towarzyszy żaden ruch tylnych kończyn. Ponadto za mobilność nie uznaje się wahadłowych wychyleń wynikających z pędu uzyskanego podczas poprzednich epizodów mobilności. Przyjrzyjmy się teraz punktacji podczas rzeczywistej sesji testu zawieszenia za ogon.
Zazwyczaj raportuje się czas unieruchomienia, a nie czas mobilności. Czas unieruchomienia można obliczyć, odejmując całkowity czas mobilności od 360 sekund czasu trwania testu. Punktacja. Test zawieszenia za ogon wymaga przeszkolenia i praktyki.
Ważne jest ustanowienie wewnętrznego standardu laboratoryjnego oraz przeszkolenie nowych obserwatorów, aż osiągną oni wysoki poziom wiarygodności. W niniejszej pracy wyjaśniamy, jak przeprowadzić i ocenić test zawieszenia za ogon. Powodzenia w przyszłych eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Test zawieszenia za ogon jest zwalidowaną procedurą behawioralną stosowaną do oceny skuteczności przeciwdepresyjnej leków u myszy. Podczas tego testu myszy są zawieszone za ogony na sześć minut, a następnie rejestruje się ich zachowania związane z próbą ucieczki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia behawioralna
- Psychofarmakologia
- Modele zwierzęce depresji
Wstęp
- Test zawieszenia ogonem jest szeroko stosowany w badaniach do oceny działania przeciwdepresyjnego.
- Test ten został zwalidowany specjalnie do stosowania u myszy i nie nadaje się do użytku u większych gryzoni.
- Umożliwia on uzyskanie informacji na temat skuteczności różnych manipulacji eksperymentalnych.
- Obserwacje behawioralne podczas testu mogą wskazywać na poziom rozpaczy lub chęć ucieczki.
Cel badania
- Zaprezentowanie procedur testu zawieszenia za ogon.
- Walidacja testu jako wiarygodnej miary skuteczności przeciwdepresyjnej.
- Zapewnienie zestandaryzowanej metody oceny reakcji behawioralnych u myszy.
Zastosowane metody
- Myszy są zawieszane za ogony na okres sześciu minut.
- Podczas czasu zawieszenia rejestrowane i analizowane są reakcje behawioralne.
- Test ocenia zachowania związane z próbami ucieczki, które są wskaźnikiem nastroju oraz poziomu lęku.
- W celu zapewnienia spójności i wiarygodności wyników stosowane są znormalizowane procedury.
Główne wyniki
- Dane behawioralne zebrane podczas testu można korelować z efektami leczenia przeciwdepresyjnego.
- Test skutecznie różnicuje wpływ różnych leków na nastrój.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia depresji oraz skuteczności leczenia w modelach zwierzęcych.
- Zestandaryzowane wyniki mogą pomóc w opracowywaniu nowych terapii przeciwdepresyjnych.
Wnioski
- Test zawieszenia za ogon jest cennym narzędziem do oceny skuteczności leków przeciwdepresyjnych u myszy.
- Stanowi on niezawodną metodę pozwalającą badaczom oceniać odpowiedzi behawioralne na stosowane terapie.
- Dalsze stosowanie tego testu może przyczynić się do lepszego zrozumienia depresji oraz jej leczenia farmakologicznego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Test zawieszenia ogona dostarcza standaryzowanego odczytu behawioralnego do oceny aktywności przeciwdepresyjnej w modelach przedklinicznych, wspierając wczesną walidację celów molekularnych oraz redukcję ryzyka mechanistycznego w przypadku związków aktywnych w ośrodkowym układzie nerwowym. Poprzez kwantyfikację zachowań zorientowanych na ucieczkę jako wskaźnika beznadziei behawioralnej, badanie to umożliwia wysokoprzepustowy screening potencjalnych środków terapeutycznych z wiarygodnością prognostyczną w odniesieniu do wskazań dotyczących zaburzeń nastroju. Test ten dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w procesach odkrywania leków, łącząc modulację farmakologiczną z mierzalnymi wynikami behawioralnymi istotnymi dla skuteczności przeciwdepresyjnej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących szlaków monoaminergicznych i glutaminergicznych zaangażowanych w regulację nastroju.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów poprzez zależne od dawki zmiany czasu unieruchomienia, co redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich w ocenie oddziaływania na cel.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację związków o trwałych efektach w zakresie behawioralnej rozpaczy w obrębie wielu chemotypów.
Przesiew i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Dostarcza ilościowe, oparte na czasie wskaźniki unieruchomienia, odpowiednie dla automatyzacji i formatów przesiewowych na płytkach.
- Powtarzalność: Standaryzowany czas utrzymywania w zawieszeniu oraz protokoły oceny minimalizują zmienność między obserwatorami, gdy spełnione zostaną wewnętrzne progi niezawodności.
- Skalowalność: Kompatybilność z wielokomorowymi pudełkami testowymi i systemami śledzenia wideo umożliwia równoległą ewaluację bibliotek związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Modeluje konstrukty behawioralnej rozpaczy z trafnością konstrukcyjną w odniesieniu do symptomatologii depresji u ludzi, co wspiera dopasowanie translacyjne biomarkerów.
- Ciągłość przedkliniczna: Stanowi pomost między walidacją celu a badaniami skuteczności w modelach przewlekłego stresu, zapewniając wczesną fazę przesiewu behawioralnego.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o statystycznie istotne redukcje unieruchomienia w porównaniu z grupami kontrolnymi otrzymującymi nośnik, co zmniejsza ryzyko inwestycyjne w późniejszych etapach.
Integracja potoków i przepływów pracy
Test zawieszenia ogona wpisuje się w kontinuum procesu badawczego, od weryfikacji hipotezy dotyczącej celu terapeutycznego, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po przedkliniczną ocenę skuteczności, szczególnie w przypadku wskazań związanych z depresją OUN, gdzie mierzalnym punktem końcowym jest behawioralna rozpacz.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez mechanistycznych poprzez pomiar reakcji behawioralnych na farmakologiczne lub genetyczne manipulacje w obwodach regulujących nastrój.
- Przesiewy: Dostarczanie wyników gotowych do analizy (czas unieruchomienia), co umożliwia porównanie grup traktowanych w badaniach zależności dawka-odpowiedź.
- Analityka: Generowanie ciągłych, mierzalnych danych (sekundy unieruchomienia), odpowiednich do porównań statystycznych i obliczania wielkości efektu.
- Badania translacyjne: Zgodność z wytycznymi FDA dotyczącymi modeli zwierzęcych w zaburzeniach psychiatrycznych poprzez ocenę głównych domen symptomatologii istotnych dla punktów końcowych badań klinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanowienie transferowalnej platformy behawioralnej, którą można zastosować w obszarach wskazań obejmujących motywację, nagrodę i przetwarzanie afektywne.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez powiązanie modulacji molekularnej z etologicznie istotnymi efektami behawioralnymi.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzowanym protokołom szkoleniowym i punktom odniesienia dla wiarygodności oceniających.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne wyeliminowanie związków pozbawionych skuteczności behawioralnej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez identyfikację związków o dawkowej i powtarzalnej odpowiedzi w testach rozpaczy behawioralnej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia z zakresu neuronauki behawioralnej w obchodzeniu się z gryzoniami oraz interpretacji etogramów, aby zapewnić dokładną ocenę ruchomości w stosunku do unieruchomienia.
- Zależy od infrastruktury do nagrywania wideo oraz kontrolowanych warunków środowiskowych (światło, dźwięk, zapach) w celu zminimalizowania zmiennych zakłócających.
- Wymaga standaryzacji kryteriów oceny między zespołami oraz przeprowadzenia testów niezawodności między sędziami przed wdrożeniem w kampaniach przesiewowych.
- Uwzględnia kwestie adaptacji do zachowań specyficznych dla szczepów myszy (np. wspinanie się po ogonie u C57BL/6), co wymaga interwencji mechanicznych, takich jak cylindry na ogon.
- Ograniczona do myszy ze względu na rozmiar aparatury i ważność behawioralną; brak możliwości przeskalowania do szczurów lub gatunków niebędących gryzoniami bez znacznej zmiany konstrukcji.
