Izolacja rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych oligomerów PrP w prawidłowym ludzkim mózgu

Celem niniejszej procedury jest wyizolowanie rozpuszczalnego i nierozpuszczalnego białka prionowego (PRP) ze wszystkich więzadeł w normalnym ludzkim mózgu. Osiąga się to poprzez wstępną homogenizację tkanki mózgowej człowieka i wyizolowanie frakcji. Następnie przeprowadza się sedymentację prędkościową w gradientach schodkowych sacharozy.

Następnie przeprowadza się chromatografię wykluczania sizerowego. Na koniec PRP jest wychwytywane przez białko G5P. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące izolację rozpuszczalnego i nierozpuszczalnego PRP lub agregatów z normalnego ludzkiego mózgu poprzez ultrawirowanie w gradientach schodkowych sacharozy, chromatografię wykluczania sizerowego oraz wychwytywanie PRP za pomocą G5P. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad chorobami prionowymi, w tym nad chorobą Creutzfeldt-Jakob, encefalopatią gąbczastą krów (BSE) oraz klinicznymi chorobami wyniszczającymi. Ponadto mogą one dostarczyć wiedzy na temat izolacji rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych agregatów białkowych nie tylko w przypadku chorób prionowych, ale także w innych schorzeniach, takich jak choroba Alzheimera i choroba Parkinsona.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tymi metodami napotykają trudności, ponieważ wszystkie etapy eksperymentalne są istotne i wymagają szczególnej uwagi. Demonstracja wideo jest w tym przypadku kluczowa, gdyż SEC Fi oraz PRP capture z G five P to kroki trudne do opisania, które mogą nie przynieść prawidłowych rezultatów bez bardziej precyzyjnego wykonania. Aby przygotować homogenat mózgu, należy zacząć od dodania 100 µL buforu lizującego do 100 mg zamrożonej tkanki mózgowej; tkankę należy homogenizować na lodzie za pomocą zmechanizowanego tłuczka, zamrozić na suchym lodzie przez pięć minut, a następnie ponownie homogenizować.

Przygotuj 20% lub 10% całkowity homogenat mózgu, dodając odpowiednio 300 lub 800 µL buforu do lizy. Przecentróż homogenat w wirówce laboratoryjnej przy 1000 G przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zbierz SNA w wirówce z rotorem SW 55, odwirowując frakcję S1 przy 35 000 RPM przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C.

Przenieś supernatant do czystej probówki. Resuspenduj pellet nierozpuszczalny w detergencie w buforze lizującym w celu przygotowania próbek do western blotu. Inkubuj frakcje S2 i P2 z proteinazą K w stężeniu 50 µg/mL przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C.

Przerwij trawienie, dodając 5 mM PMSF oraz bufor do próbek z SDS. Gotuj próbki przez 10 minut, a następnie pozostaw je w temperaturze pokojowej na 5 minut. Aby przeprowadzić sedymentację prędkościową, zacznij od inkubowania 450 µL frakcji S1 20% z równą objętością wody z 2% Sarco X na lodzie przez 30 minut w probówkach wirówkowych o pojemności 5 ml. Dodaj po 0,5 ml sacharozy o stężeniach 60%, 30%, 25%, 20%, 15% i 10%. Nanieś 0,4 ml inkubowanego S1 na górę gradientu sacharozy 10-60%.

Wiruj gradienty skokowe w rotorze SW 55 przy 48 000 RPM przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, pobierając próbki od góry probówki. Zbierz 12 równych frakcji po 283 µl każda. Użyj 20 µl z każdej frakcji oraz równą objętość buforu do próbek SDS.

Przygotowanie próbek do żelu SDS-PAGE. Gotuj próbki przez 10 minut, a następnie chłodź je przez cztery minuty. Odwiruj próbki w wirówce z prędkością 1000 G przez jedną minutę.

Następnie wymieszaj je w wortexie przed naniesieniem na gotowy żel do wykluczania molekularnego. Chromatografia jest stosowana w celu określenia stanu oligomerycznego cząsteczek PRP. Rozpocznij od naniesienia próbek o objętości 200 µL siedmiu poszczególnych markerów masy cząsteczkowej na kolumnę o wymiarach 1 x 30 wypełnioną kulkami SUEx 200 HR.

Przyjmij objętość elucji niebieskiego dekstranu jako objętość martwą. Oblicz objętości elucji piku VE na podstawie chromatogramu i retencji frakcji. Oblicz współczynnik podziału KAV, korzystając z równania KAV równa się V minus V zero podzielone przez VT minus V zero.

W celu wygenerowania krzywej kalibracyjnej należy wykreślić KAV standardów białkowych w funkcji logarytmu masy cząsteczkowej standardów. Następnie należy nanieść 200 µL próbki S one na kolumnę przy szybkości przepływu 0,25 mL/min.

Przemyj kolumnę buforem do lizy 1%cile, a następnie za pomocą kolektora frakcji wyługuj frakcje o objętości 0,25 ml. Inkubuj 125 µL z każdej frakcji z 500 µL schłodzonego wcześniej metanolu w temperaturze -20 °C przez dwie godziny. Odwiruj próbki przy 13 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.

Reese, rozpuść osad w 20 µL buforu do próbek SDS i gotuj przez 10 minut. Schłodź do temperatury pokojowej i rozdziel na 15% żelach poliakrylamidowych. Wykorzystaj krzywą wzorcową do ekstrapolacji mas cząsteczkowych różnych odzyskanych gatunków PRP w celu sprzęgnięcia cząsteczki G5P z kulkami magnetycznymi.

Inkubuj 100 µg G5P z 350 µL aktywowanych magnetycznych kulek toci w 1 mL PBS w temperaturze 37 °C przez 20 godzin. Użyj zewnętrznego magnesu, aby przyciągnąć kulki G5P do ścianki probówek Eppendorf, a następnie usuń roztwór. Przemyj kulki trzy razy 1 mL PBS z 0,1% BSA, aby zablokować niespecyficzne wiązanie.

Inkubować kulki sprzężone z G5P w 1 ml 0,2 M buforu Tris-HCl pH 7,4 zawierającego 0,1% BSA przez pięć godzin w temperaturze 37°C. Następnie przemyć kulki trzykrotnie. Usunąć ostatni płucznik i dodać 1 ml PBS w celu wyizolowania PRP. Inkubować 100 µl S1 lub P2 z 60 µl kulek sprzężonych z G5B w 1 ml buforu wiążącego przy stałej rotacji przez trzy godziny w temperaturze pokojowej.

Umieść probówkę na magnesie. Usuń roztwór i przemyj kuleczki trzykrotnie buforem do mycia. Usuń ostatnią porcję buforu i dodaj bufor do próbek SDS.

Podgrzewaj kuleczki w temperaturze 95°C przez pięć minut. Naniesienie próbek na gotowe żele 15% i prowadź elektroforezę przy napięciu 150 V przez około 80 minut. Przenieś białka na membranę PVDF przy napięciu 70 V przez dwie godziny, po uprzednim zablokowaniu membran w 5% mleku w TBST.

Inkubuj je przez dwie godziny w temperaturze pokojowej z przeciwciałami przeciwko PRP. 3F4 i 1E4 anty-N lub anty-C. Po inkubacji z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP inkubuj membranę z roztworem chemiluminescencyjnym zgodnie z instrukcjami producenta i naświetl film, jak pokazano tutaj, w porównaniu z próbkami sporadycznego vCJD, sCJD lub CJD. W frakcji P2 z normalnych mózgów wykryto niewielką ilość nierozpuszczalnego komórkowego PRP.

Jednak większość odzyskano w frakcji S dwa. Nierozpuszczalne PRP stanowi około 5 do 25% całkowitego PRP, w tym gatunki pełnowymiarowe i ucięte z końców. Analizy z wykorzystaniem sedymentacji w gradientowym stopniu stężenia sacharozy wykazały, że o ile większość PRPC z mózgów bez CJD odzyskano w górnych frakcjach, jeden trzy, to niewielkie ilości PRP wykryto również w dolnych frakcjach dziewięć 11, które zazwyczaj zawierają duże agregaty. Różnorodne gatunki patogennego PRP lub PRP SC, od monomerów.

Mniejsze ligandy oraz większe agregaty wyizolowano za pomocą filtracji żelowej z mózgu z chorobą yakup z zaworem CRUT. Co zaskakujące, niewielka ilość większych agregatów o masie cząsteczkowej przekraczającej 2000 kilodaltonów została wykryta również w frakcjach nierozpuszczalnych prawidłowych mózgów. Co więcej, dimery i tetramery PRPC wykryto nie tylko w frakcjach nierozpuszczalnych, ale także w frakcjach nierozpuszczalnych.

Po traktowaniu PK i PNGaza. PRP wychwycone przez G5P wykryto za pomocą przeciwciała 1E4 przeciwko PRP 97 1 0 5 3. Wykryto fragmenty rdzenia odporne na PK, nazwane PRP*20, PRP*19 i PRP*7, które migrowały odpowiednio na poziomie 20 kDa, 19 kDa i 7 kDa.

Jednak nie wykryto PRP, gdy przeciwciało one E four inkubowano wcześniej z syntetycznym peptydem o sekwencji identycznej z epitopem one E four, co wskazuje, że prążki wykryte przez one E four są fragmentami PRP. Przeciwciało anti C wykryło dwa różne fragmenty PRP migrujące w okolicy 18 kilodaltonów oraz około 12 do 13 kilodaltonów. Dodatkowo do metody PRP ETE 20 Once.

Technikę tę można przeprowadzić w ciągu czterech dni, jeśli jest ona wykonywana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak izolować rozpuszczalne i nierozpuszczalne polimery PRP w dolnych obszarach ludzkiego mózgu po ich rozwoju. Technika ta utorowała drogę do badań nad losem przed eksploracją informacji o potwierdzeniu PIP w mózgu.