System hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej

Celem niniejszego eksperymentu jest zademonstrowanie, w jaki sposób pierwotny układ kultur neuronów może zostać wykorzystany do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki prostego. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez wyizolowanie neuronów z zwojów szyjnych górnych embrionów szczurów rasy RA, a następnie hodowlę neuronów wyizolowanych z dysocjowanych zwojów po usunięciu komórek nieneuronalnych. Latentna infekcja HSV jest ustanawiana przy użyciu wirusa EGFP do zakażenia neuronów w obecności inhibitora replikacji litycznej.

Kolejnym krokiem jest indukowanie reaktywacji latentnych zakażonych kultur. Na koniec wydajność reaktywacji ocenia się poprzez monitorowanie ekspresji EGFP w czasie. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące, w jaki sposób różne szlaki sygnałowe neuronów regulują latencję i reaktywację wirusa herpes simplex, z wykorzystaniem inhibitorów chemicznych, interferencji RNA oraz dostarczania genów.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że umożliwia ona szczegółowe badania oddziaływań regulujących latencję wirusa prostego opuszki w neuronach gospodarza na poziomie molekularnym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie latencji wirusa prostego opuszki, takie jak: jakie sygnały odpowiadają za represję genomu latentnego oraz w jaki sposób na poziomie molekularnym wyzwalana jest reaktywacja? W neuronach metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat latencji HSV1.

Metodę tę można zastosować również do innych neurotropowych wirusów alfaherpes. Procedurę zaprezentują Marigo Kochi i Julian Kim, oboje doktoranci w naszych laboratoriach. Neurony z yczennych zwojów szyjnych (SCG) do niniejszego protokołu izoluje się z embrionów szczura w 21. dniu rozwoju (E 21), które zostały wyjęte z macicy ciężarnej samicy szczura. Pracując pod dygestorium sekcyjnym, należy uśmiercić każdego embriona, kierując nożyczki w podstawę szyi, tuż nad barkami, i oddzielając głowę od tułowia. Aby odsłonić zwoje, należy użyć igieł o rozmiarze 23 G do przypięcia głowy w trzech miejscach, ustawiając ją stroną szyi do góry.

W pierwszej kolejności przymocuj rdzeń kręgowy za pomocą szpilek. Po drugie, odciągnij skórę przednią nad nos i przymocuj ją szpilką, a po trzecie przymocuj przełyk i tchawicę, odsuwając je od karku. Zlokalizuj SCG, odnajdując miejsce rozwidlenia tętnicy szyjnej.

Tętnica szyjna jest strukturą parzystą. Po obu stronach szyi znajdują się dwie rozwidlenia, zatem dwie s CGS na osobę. SCG znajduje się bezpośrednio pod rozgałęzieniem.

Oddziel SCG od tętnic, rozciągając rozwidlenie za pomocą obu końców. SCG jest półprzezroczyste i bezbarwne w porównaniu do nieprzeźroczystej, żółtawej tkanki tłuszczowej otaczającej rozwidlenie. Umieść zwoje w 12 mililitrach L 15.

Pożywka uzupełniona glukozą w 15-mililitrowej probówce stożkowej na lodzie. Po zebraniu wszystkich SCG z embrionów i delikatnym wyciągnięciu zwojów, odwiruj je przez jedną minutę przy 600 RPM, a następnie usuń nadmiar pożywki.

Zzawiesić zwoje w 1 ml pożywki L 15 zawierającej trypsynę i kolagenazę. Inkubować przez 24 minuty w temperaturze 37 °C.

Mieszać co osiem minut. Następnie dodać 10 mililitrów pożywki morskiej, aby zneutralizować trypsynę, i wirować przez jedną minutę. Przy 600 RPM usunąć jak największą ilość pożywki z trypsyną i kolagenazą, a następnie przemyć zwoje 10 mililitrami pożywki C, wirować przez jedną minutę przy 600 RPM.

Powtórz to płukanie raz. Usuń medium płuczące i resuspenduj zwoje w 1 ml medium C, aby przeprowadzić dysocjację poprzez tytrację, używając igły 21 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 5 ml, wykonując maksymalnie 15 cykli zasykania i wypychania. Zakończ tytrację przy użyciu igły 23 G, aż większość grudek zostanie rozdzielona.

Usuń wszelkie pozostałe skupiska komórek, filtrując dysocjowane neurony przez nylonowy filtr o rozmiarze 70 micron do probówki stożkowej o pojemności 50 milliliter. Pobierz 10 microliter aliquot zawiesiny komórkowej po filtracji i zmieszaj z triam blue w celu oznaczenia liczby żywych komórek. Policz liczbę komórek aktywnie wykluczających barwnik, używając hemo cytometer.

Następnie do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli tkanek, uprzednio pokrytej kolagenem i lamininą, przenieś od 5 000 do 6 000 żywych komórek w 100 µL pożywki C zawierającej 50 ng/mL czynnika wzrostu nerwów. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia, w pierwszym dniu in vitro (DIV 1), sprawdź poprawność przytwierdzenia neuronów oraz wzrost niektórych projekcji aksonalnych.

Zastąp medium C w dołkach 50 µL medium podstawowego dla neuronów (neuro basal medium) lub NBM zawierającego NGF Acho oraz 5-fluorodoksyurydynę. Wymieniaj medium w jednym rzędzie na raz, aby zapobiec wysychaniu komórek. Inkubuj hodowle w temperaturze 37 °C przez pięć dni.

Monitoruj kulturę codziennie, aby potwierdzić śmierć komórek nieneuronalnych oraz wzrost neuronów. Aby rozpocząć tę część procedury w szóstym dniu in vitro, sprawdź, czy większość nieneuronalnych komórek wspierających została wyeliminowana. Niezmiernie ważne jest, aby w każdym momencie minimalizować niepotrzebne manipulacje fizyczne neuronami.

Wymiana pożywki musi być przeprowadzona bardzo delikatnie i powoli, aby uniknąć stresu mechanicznego, który mógłby wpłynąć na żywotność neuronów. Do istniejącej pożywki w każdej studzience należy dodać acyklowir lub CV do końcowego stężenia 100 micromolar. CV należy dodawać powoli i delikatnie, aby siły mechaniczne nie wpłynęły negatywnie na komórki w dniu następnym.

W siódmym dniu in vitro (DIV 7) zainfekuj kultury SCG rekombinowanym wirusem HSV-1, który wykazuje ekspresję reportera EGF połączonego z wirusowym białkiem litycznym US 11, przy wielokrotności zakażenia (MOI) od 1 do 2. Dodaj rozcieńczony wirus bezpośrednio do istniejącej pożywki w studzience. Uwzględnij kontrolę z pozorną infekcją oraz infekcję lityczną.

Kontrola pozytywna w pożywce bez CV. Pozostawić infekcję na dwie do trzech godzin w temperaturze 37°C. Następnie zastąpić pożywkę do infekcji świeżą pożywką NBM zawierającą NGF oraz CV. Kluczowe jest zachowanie ogromnej ostrożności podczas wymiany pożywki do infekcji. Przechylić płytkę w swoją stronę i powoli usunąć pożywkę z dna dołka.

Następnie skieruj końcówkę pipety w stronę ścianki dołka, a nie jego dna, i pozwól, aby pożywka łagodnie spłynęła na komórki. Wymieniaj pożywkę w jednym rzędzie naraz, aby zapobiec wysychaniu komórek. Przenieś kultury z powrotem do inkubatora, obchodząc się z nimi jak najdelikatniej, aby nie naruszyć ich zdolności do podtrzymywania latencji HSV 1.

Kultury należy utrzymywać przez sześć dni w temperaturze 37°C, w czasie którego wirus wejdzie w stan latencji. W tym okresie należy używać mikroskopu fluorescencyjnego do monitorowania ekspresji us 11 EGFP jako wskaźnika replikacji litycznej.

Zgodnie z oczekiwaniami, w kontroli z pozorowaną infekcją nie powinno wystąpić ekspresji GFP. S 11 EGFP powinno być wykryte wyłącznie w próbkach zainfekowanych. Studzienki kontroli pozytywnej bez zastosowania CV wskazują na przebieg udanej pierwotnej infekcji oraz produktywną replikację lityczną.

Aby ocenić reaktywację w 14. dniu in vitro (DIV 14), ostrożnie zastąp medium zawierające CV świeżym medium bez CV, postępując jak poprzednio. Skieruj końcówkę pipety w stronę ścianki studni, a nie dna, i pozwól medium delikatnie spłynąć na komórki, jeśli jest to stosowne. Uwzględnij zmienne farmakologiczne lub biologiczne, takie jak LY 2 9 0 0 4 w stężeniu 20 µM.

W kulturach z utajoną infekcją traktowanych A CV nie powinna być wykryta ekspresja GFP. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez okres od pięciu do sześciu dni. Monitoruj żywe kultury za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu wykrycia neuronów ulegających reaktywacji.

Częstotliwość reaktywacji oblicza się poprzez zliczenie liczby studni zawierających neurony pozytywne pod kątem EGFP i wyrażenie tej wartości jako proporcji do całkowitej liczby studni z próbkami. Rysunek ten przedstawia przykład, w którym do późnych kultur zakażonych SCG zastosowano trigger statin, znany induktor reaktywacji. Reaktywację monitorowano i oceniano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej codziennie po podaniu leku przez okres pięciu dni.

W przypadku TSA reaktywacja osiąga 50% wartości maksymalnej w ciągu dwóch dni, a do piątego dnia reaktywacja osiąga 60% poziomu bazowego lub spontanicznego, reprezentowanego przez DMSO. W tym eksperymencie w leczonych kulturach kontrolnych wartość ta wynosi około 10%, a w tym systemie in vitro zazwyczaj mieści się w przedziale od 5 do 20%. Później w zakażonych kulturach SCG zastosowano również LY 2 9 0 0 4.

Porównano kultury z indukowaną reaktywacją za pomocą znanego induktora reaktywacji LY z kulturami traktowanymi inhibitorem syntezy viralnego DNA, kwasem fosfonooctowym (PAA), oraz obiema związkami jednocześnie, jak pokazano tutaj. Ekspresja US 11 EGFP jest upośledzona przez PAA w kulturach indukowanych do reaktywacji za pomocą LY 2 9 4 0 0 2, co wskazuje, że ekspresja US 11 EGFP zależy od replikacji viralnego DNA. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest ścisłe przestrzeganie zasad aseptyki oraz jak najdelikatniejsze obchodzenie się z kulturą CG, aby uniknąć zwiększonej spontanicznej reaktywacji wywołanej stresem lub ruchami mechanicznymi. Po zastosowaniu tej procedury w celu ustanowienia utajonych infekcji HSV one w hodowlach neuronów, można przeprowadzić inne metody, takie jak wyciszanie za pomocą shRNA oraz ekspresja ektopowa genu typu dzikiego i mutantów z utratą funkcji, aby scharakteryzować funkcje neuronalne regulujące latencję i reaktywację HSV one.

Należy pamiętać, że HSV-1 jest patogenem ludzkim, który wymaga zachowania środków ostrożności zgodnych z poziomem bezpieczeństwa BSL-2. Przed przystąpieniem do tej procedury należy zapoznać się z zasadami pracy w warunkach BSL-2. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak tworzyć kultury SCG w celu ustanowienia latentnych infekcji HSV-1 oraz jak skutecznie indukować reaktywację w neuronach.