Hodowla i zastosowania trójwymiarowych modeli komórek nabłonkowych otrzymywanych w bioreaktorze z rotującą ścianką (Rotating Wall Vessel)

Niniejszy niekonwencjonalny protokół przedstawia prosty i niezawodny system hodowli ludzkich komórek nabłonkowych w formie organotypowych modeli 3D, które odtwarzają tkankę ludzką in vivo. Najpierw komórki nabłonkowe hoduje się do uzyskania konfluencyjnej monowarstwy w kolbie do hodowli tkanek, następnie je zbiera i łączy z mikronośnikami w bioreaktorze STLV; platforma z bioreaktorem STLV jest obracana w celu stworzenia środowiska stałego swobodnego spadku o niskim ścinaniu cieczy, co pozwala komórkom przytwierdzić się i rosnąć na kuleczkach oraz tworzyć agregaty komórkowe po 96 godzinach i w przybliżeniu każdego kolejnego dnia.

Uzupełniaj pożywkę w SDLV, aby zapewnić warunki dla metabolizmu komórkowego podczas formowania się agregatów. Raz w tygodniu wykonuj zdjęcia próbek za pomocą mikroskopii świetlnej, aby monitorować postępy rozwoju, aż do momentu pełnego sformowania się agregatów i zajścia różnicowania komórkowego. Wykorzystaj agregaty do dalszych analiz eksperymentalnych i testów. Ostatecznie system ten pozwala na generowanie organotypowych modeli przypominających warunki in vivo dla wielu rodzajów badań naukowych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalna hodowla komórkowa, jest to, że komórki nabłonkowe różnicują się i polaryzują w agregaty przypominające tkankę, wykazując tym samym morfologię i funkcje zbliżone do autentycznej tkanki ludzkiej. Ten trójwymiarowy system modelowy pozwala na głębsze zrozumienie biologii komórek nabłonkowych, interakcji między gospodarzem a patogenem oraz złożonych zależności między typami komórek, które mogą zostać wprowadzone do systemu. Dr Andrea Radkey.

Postdoc z mojego laboratorium zademonstruje teraz procedurę detoksykacji bioreaktora z bocznymi naczyniami o wolnym przepływie. Przykryj otwarte porty nasadkami typu luer. Napełnij STLV 95% etanolem i inkubuj w celu wyrównania stężeń przez 24 godziny.

Usunąć etanol, następnie napełnić sterylną wodą destylowaną i inkubować przez 24 godziny; używając narzędzi dostarczonych przez dostawcę, poluzować wszystkie śruby i wyjąć centralny korek z STLV. Umieścić je w woreczku do sterylizacji i poddać autoklawowaniu w temperaturze 110 °C przez 20 minut. Złożyć STLV i powtórzyć detoksykację, aby zapewnić sterylność.

Następnie dokręć śruby STLV. Do każdego portu podłącz wstępnie wysterylizowany zawór jednokierunkowy. Teraz wyjmij tłoki z 10-mililitrowej i 5-mililitrowej strzykawki typu Luer Lock i pozostaw tłoki w opakowaniach.

Aby zachować sterylność, przykręć strzykawki do kurka odcinającego. Następnie dodaj DPBS do strzykawki 10 ml, aż STLV zostanie wypełnione, a strzykawka 5 ml zacznie się napełniać. Po tym wsuń sterylne tłoki do każdej ze strzykawek i usuń wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza z bioreaktora, naprzemiennie przesuwając tłoki strzykawek.

Zamknąć kurki i przymocować STLV do obrotowej platformy pionowej. Obracać przez minimum 24 godziny, aby monitorować szczelność w probówce stożkowej o pojemności 50 mililitrów. Dodać 15 mililitrów DPBS do 250 miligramów kulek cyto dex microcar i wysterylizować w autoklawie po schłodzeniu.

Wypłucz DPBS trzykrotnie, używając pożywki hodowlanej dla komórek nabłonkowych. Zakręcaj probówką, aby ponownie zawiesić kuleczki. Następnie resuspenderuj kuleczki w 15 mililitrach pożywki hodowlanej.

Najpierw w hodowli tkankowej, w kolbach, namnażamy 1×10⁷ komórek nabłonkowych w formie monowarstw. Następnie zbieramy komórki, dokonujemy ich zliczenia oraz oznaczamy żywotność komórkową metodą wykluczania błękitu trypanu. Po barwieniu nanosimy komórki na przygotowane koraliki.

Przepłucz probówkę stożkową, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały przeniesione. Następnie usuń DPBS oraz strzykawki z STLV. Usuń również korek z portu centralnego, używając pipety serologicznej o pojemności 10 mililitrów.

Przenieś zawiesinę kuleczek z komórkami nabłonkowymi do STLV. Przepłucz probówkę stożkową raz, aby przenieść wszystkie komórki i kuleczki. Następnie załóż z powrotem korek portu centralnego.

Następnie wyjmij tłoki z strzykawki o pojemności 5 ml oraz 10 ml i pozostaw je w opakowaniach. Aby zachować sterylność, zakręć otwory strzykawek za pomocą otwartych kraników. Napełnij STLV pożywką.

Włóż tłoki i zamknij kurek. Następnie inkubuj nowo zaszczepioną kulturę STLV w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 30 minut bez rotacji. Po wyjęciu STLV z inkubatora otwórz kurek.

Usuń pęcherzyki powietrza za pomocą tłoków i zamknij kranik. Następnie ustaw STLV na rotację ciągłą z prędkością 20 RPM w inkubatorze. Po 96 do 120 godzinach wymień pożywkę, wyjmując strzykawki i otwierając oba kraniki STLV, aby umożliwić osiadanie kulek i komórek.

Po osadzeniu komórek odessać około 75% pożywki przez port boczny za pomocą strzykawek, aby przeprowadzić protokół dokarmiania. Ponownie uzupełniać pożywkę w miarę potrzeb, w zależności od metabolizmu komórkowego. Należy również monitorować wzrost i żywotność agregatów co pięć do siedmiu dni.

Aby uniknąć rozrywania agregatów, należy użyć końcówki do pipety 1000 µL, odciętej około dwóch centymetrów od wierzchołka i wysterylizowanej. Ostrożnie należy pobrać 200 µL agregatów z otworu centralnego i rozdzielić je do dwóch probówek 1,5 mL. Jedną porcję należy przeznaczyć do monitorowania żywotności komórek. Po oddzieleniu komórek od kulek należy ocenić żywotność za pomocą metody wykluczania błękitu trypanu.

Barwienie w celu obrazowania agregatów komórkowych. Do drugiej porcji agregatów o objętości 1,5 ml dodaj od 0,5 do 1 ml pożywki i przenieś do małej szalki Petriego, używając uciętej końcówki pipety o pojemności 1000 µL. Obrazuj agregaty.

W przypadku niektórych modeli komórek nabłonkowych, przy użyciu odwróconego mikroskopu świetlnego, konieczne jest przeniesienie agregatów do jednorazowego naczynia w celu zwiększenia napowietrzania hodowli na około tydzień przed ich zbiorami. Do analizy należy wyjąć strzykawki z STLV i odlać około 50% pożywki przez boczny port. Następnie należy wyjąć centralny korek i ostrożnie przelać całą zawartość przez port centralny do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów.

Przepłucz STLV dwukrotnie pięcioma mililitrami pożywki i połącz płukanki z zebranymi agregatami. Następnie przenieś agregaty z 50 mililitrowej probówki stożkowej do Harv. Po jednym tygodniu ostrożnie zbierz agregaty do potencjalnych formatów testowych, analiz i badań; w systemie bioreaktora STLV hodowano zróżnicowane ludzkie agregaty nabłonkowe.

Obrazy SEM i TEM zostały pozyskane z ludzkich komórek pochwy hodowanych w STLV przez 39 dni. Należy zauważyć, że agregaty 3D wykazują cechy ultrastrukturalne podobne do tkanek: mikrofałdy, inwaginacje, wewnątrzkomórkowe pęcherzyki wydzielnicze oraz mikrokosmki na powierzchni apikalnej. Obrazy z konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej komórek pochwy 3D wskazują na ekspresję mucyny oraz markerów specyficznych dla komórek nabłonkowych i różnicowania terminalnego. Fenotypy istotne fizjologicznie stanowią również doskonałą platformę do oceny toksyczności związków.

Test MTT, powszechnie stosowana metoda pomiaru żywotności, metabolizmu lub proliferacji komórek, może być wykorzystywany do oceny toksyczności różnych chemikaliów i związków. Alternatywnie, toksyczność po traktowaniu związkami testowymi można zmierzyć za pomocą metody wykluczania błękitu trypanu. W tym przykładzie, po traktowaniu NONOXINOL-em nine, agregaty pochwowe wykazały odpowiedź toksyczną podobną do tej w modelach eksplantów szyjki macicy, lecz inny profil w porównaniu do monowarstw.

Agregaty 3D są funkcjonalnie reaktywne, na przykład w odpowiedzi na stymulację cząsteczkami pochodzącymi z drobnoustrojów, które są rozpoznawane przez receptory toll-like. Agregaty reagują poprzez wydzielanie cytokin prozapalnych, w tym białka IL6 oraz ekspresję transkrypcyjną receptora progesteronu. W komórkach pochwy można również zaobserwować receptor reagujący na stymulację hormonalną.

Agregaty 3D nie tylko wykazują zdolność do reagowania na cząsteczki patogenów i hormonów, ale są również w stanie funkcjonalnie wspierać infekcję wirusem prostego opryszczki typu 2. Obraz z mikroskopii konfokalnej zainfekowanych HSV 2 agregatów pochwowych 3D potwierdza obecność infekcji. Właściwości fizyczne i funkcjonalne pojedynczych komórek w obrębie agregatów mogą być również ilościowo określane za pomocą cytometrii przepływowej, na przykład poprzez analizę cytometryczną w celu pomiaru ekspresji powierzchniowej mucyna 1 na pojedynczych komórkach pochwy.

Trójwymiarowe agregaty pochwowe wykazały niższy procent mucyny 1 na swojej powierzchni w porównaniu do monowarstw po ich rozwoju. Technika ta pozwoliła badaczom z dziedziny biologii tkanek i chorób zakaźnych na badanie struktury oraz odpowiedzi fizjologicznych na bodźce. Dzięki zastosowaniu tych modeli organotypowych lepiej odwzorowujemy biologię człowieka.