Przesiewowe badanie oddziaływań pozakomórkowych oparte na awidności (AVEXIS) w celu skalowalnej detekcji słabych oddziaływań między pozakomórkowymi receptorami a ligandami

Ogólnym celem niniejszej procedury jest odkrycie nowych zewnątrzkomórkowych oddziaływań białkowych zaangażowanych w procesy rozpoznawania komórkowego, w szczególności w przypadku białek receptorowych osadzonych w błonie. Metoda AveXis została opracowana, aby obejść problem bardzo słabych powinowactw oddziaływań, które są charakterystyczne dla tej klasy interakcji białkowych, a także fakt, że białka błonowe są trudne do manipulacji biochemicznej. Osiąga się to poprzez wstępne stworzenie biblioteki białek rekombinowanych obejmującej regiony zewnątrzkomórkowe receptorów powierzchni komórki.

Osiąga się to poprzez zaprojektowanie plazmidów ekspresyjnych produkujących regiony domeny zewnątrzkomórkowej receptorów jako fragmenty rozpuszczalne, zarówno w formie monomerycznych biotynilowanych przynęt (baits), jak i pentamerycznych białek prey z tagiem enzymatycznym. Drugim krokiem jest ekspresja i normalizacja białek w celu przygotowania ich do przesiewania oddziaływań. Wszystkie białka są produkowane w komórkach ssaków, aby zapewnić wprowadzenie modyfikacji potranslacyjnych, takich jak mostki dwusiarczkowe i glikozylacja.

Kluczowym krokiem w protokole jest zapewnienie, że białka przynęty (bait) i białka ofiary (prey) w bibliotece są znormalizowane do poziomów mieszczących się w określonych wartościach progowych. Następnie przechodzi się do najważniejszego etapu, czyli przesiewania w poszukiwaniu nowych oddziaływań. Przynęty są rozmieszczone w poszczególnych dołkach płytki mikrotitracyjnej, a następnie badane pod kątem oddziaływań z wykorzystaniem ofiar.

Następnie przeprowadza się etap płukania. Ostatnim krokiem jest dodanie substratu dla enzymu w celu wykrycia wszelkich uchwyconych ofiar na matrycach białek-przynęt. W ostateczności wyniki przesiewania VEX mogą wykazać, które receptory powierzchniowe komórek są zdolne do tworzenia partnerów wiążących i mogą być zatem zaangażowane w procesy rozpoznawania i komunikacji między komórkami.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu do popularnych metod ekstrakcji białek, takich jak system drożdżowy dwuhybrydowy czy oczyszczanie biochemiczne, jest to, że została ona zaprojektowana specjalnie do wykrywania zewnątrzkomórkowych oddziaływań białko-białko. Jest ona szczególnie odpowiednia do odkrywania nowych interakcji między receptorami zakotwiczonymi w błonie. Oddziaływania te są trudne do wykrycia przy użyciu innych technik, ponieważ białka błonowe są trudne do manipulacji biochemicznej, a ich typowe interakcje z receptorami przeciwstawnymi są niezwykle słabe.

Ta metoda może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób komórki rozpoznają się i komunikują ze sobą. Na poziomie molekularnym można ją wykorzystać do badania podstawowych procesów biologicznych, takich jak określenie, które białka receptorowe występujące na powierzchni komórek jajowych i plemników łączą się ze sobą, lub które interakcje ligand-receptor odpowiadają za zjawiska komórkowe, takie jak fuzja miocytów czy formowanie się grzebienia neuronalnego. Głównym wyzwaniem w tym podejściu jest stworzenie bibliotek białek typu „bait and pray”, w których prowadzone jest przesiewanie w celu znalezienia interakcji.

Bardzo ważne jest również upewnienie się, że stężenia białek przynęty (bait) i ofiary (prey) są znormalizowane w ramach poziomów progowych wymaganych dla danego testu. Pozwala to ograniczyć częstotliwość występowania wyników fałszywie ujemnych i fałszywie dodatnich. Pomysł na tę metodę pojawił się u mnie podczas studiów doktoranckich, kiedy próbowałem zidentyfikować partnera wiążącego dla białka powierzchni komórkowej CD 200.

W zasadzie zadawałem pytanie: jaki jest wzór wiązania dla tego konkretnego receptora powierzchniowego komórki? Nawet dzisiaj pozostaje to pytanie trudne do udzielenia odpowiedzi od strony technicznej, jednak w tamtym czasie sekwencjonowanie genomu ludzkiego było bliskie ukończenia i zdałem sobie sprawę, że skoro dysponujemy teraz pełną listą wszystkich receptorów powierzchniowych komórki w genomie, możemy zamiast tego zapytać, które z tego zestawu białek receptorowych mogą wchodzić ze sobą w interakcje techniczne.

Odpowiedź na to pytanie jest znacznie prostsza, a metoda AveXis została opracowana właśnie po to, aby ją uzyskać. Po utworzeniu biblioteki wektorów dla białek przynęty (bait) i białek ofiary (prey), należy przygotować się do ich transfekcji do komórek HEC 2 9 3 E. Rozpocznij od wysiania komórek w dniu poprzedzającym transfekcję, z gęstością 250 000 komórek na mililitr w 50 mililitrach pożywki freestyle 2 9 3, aby zapewnić efektywną biotinylację. Pożywkę używaną do produkcji białek przynęty, a nie białek ofiary, uzupełnij o d biotin. Po przygotowaniu wszystkich płytek inkubuj komórki przez noc w standardowych warunkach.

Ze względu na niską rozpuszczalność biotyny i trudności w przygotowaniu dokładnego roztworu, zaleca się odważenie dodatkowej biotyny, dodanie jej do medium, a następnie energiczne wstrząsanie w dniu następnym. Przeprowadzić transfekcję 50 ml hodowli komórek za pomocą 25 µg plazmidu przynęty (bait) lub ofiary (prey), używając odpowiedniego odczynnika do transfekcji w celu wytworzenia biotynilowanych przynęt. Współtransfekcję konstruktu przynęty z plazmidami kodującymi wydzielaną formę białka ligazy biotyny ELI należy przeprowadzić w stosunku 10:1 przed zbiorem.

Kultury pięć dni po transfekcji poddano najpierw wirowaniu komórek przy 3000 ×g przez 20 minut, a następnie przefiltrowano supernatant przez filtr 0,22 µm. Jedną z kluczowych cech systemu AveXis jest to, że białka rekombinowane są wydzielane, dzięki czemu można je rozcieńczać lub zagęszczać do uzyskania aktywności mieszczącej się w zakresach progowych. Stwierdzono, że białka rekombinowane wykazują zmienną ekspresję w zakresie do czterech rzędów wielkości, zatem etap normalizacji zmniejsza występowanie wyników fałszywie dodatnich podczas etapów przesiewania.

Aby rozpocząć normalizację przynęty, należy usunąć z medium nie sprzężoną biotynę za pomocą dializy, ponieważ będzie ona konkurować o wiązanie biotynilowanego białka przynęty w miejscach wiązania streptawidyny; proces ten należy rozpocząć od umieszczenia przynęty w tubie dializacyjnej. Aby zapewnić skuteczną dializę białek rekombinowanych, ustalono, że ważne jest zapewnienie nadmiarowej powierzchni membrany tuby dializacyjnej. Zazwyczaj stosuje się od dwóch do trzech razy więcej tuby, niż jest to faktycznie wymagane dla dializowanej objętości.

Przez okres 24 godzin przeprowadzić intensywną dializę przynęty przeciwko odpowiedniemu buforowi, np. PBS. Test ELISA rozpocząć od blokowania dołków płytki mikrotytryjnej z unieruchomionym streptawidyną za pomocą PBST zawierającego BSA przez 15 minut. W międzyczasie, na czystej płytce, przygotować serię czterech rozcieńczeń białek przynęty w stosunku 1:3 w PBST z 2% BSA.

Po 15-minutowej inkubacji przenieś rozcieńczenie na płytkę kodowaną strep TTR i inkubuj płytkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie wypłucz dołki, a następnie do każdego z nich dodaj 100 µL OX 68 w stężeniu 2 µg/mL. Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez kolejną godzinę. Po drugiej inkubacji przeprowadź ponowną serię płukań i nałóż na płytkę przeciwciała anty-US sprzężone z fosfatazą alkaliczną.

Inkubuj płytkę przez trzecią godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj płytkę trzy razy w PBST, a na koniec przemyj ją w PBS. Aby usunąć pozostałości detergentu, po godzinie dodaj 100 µL substratu 1 0 4 o stężeniu 1 mg/mL w buforze z dietanolaminą.

W temperaturze pokojowej zmierz absorbancję przy 405 nm. Serię rozcieńczeń czterech różnych dializowanych nadsączów przynęty wykryto metodą ELISA przy użyciu przeciwciała monoklonalnego przeciwko znacznikowi CD4. Jeśli nierozcieńczone białka przynęty nie są wystarczające do nasycenia wszystkich miejsc wiązania biotyny na płytce pokrytej streptawidyną, należy skoncentrować białko za pomocą koncentratora VivaSpin. W przeciwnym razie należy użyć białka przynęty w rozcieńczeniu w buforze PBST z 2% BSA.

Jest to ilość wystarczająca do nasycenia miejsca wiązania biotyny w teście. Ilościowo określ względne poziomy ekspresji białek prekursorowych, wykorzystując aktywność enzymatyczną beta-laktamazy. Rozpocznij od przygotowania serii rozcieńczeń naddatku zawierającego paraproteiny w buforze PBST 2% BSA.

Następnie dodaj 20 µL rozcieńczenia do 60 µL roztworu nitrous stepin naniesionego na płytkę. Bezzwłocznie przenieś płytkę do czytnika płytek i mierz absorbancję przy 485 nm co minutę przez kolejne 20 minut, używając koncentratorów odśrodkowych lub rozcieńczając w PBST z 2% BSA. Ustaw końcowe stężenie próbek tak, aby wszystkie nitrosy w teście uległy hydrolizie w około siedmiu minutach, co odpowiada obrotowi około dwóch ol nitros na minutę.

Przesiewanie AveXis należy rozpocząć od przemycia płytki powlekanej strep TAVR ENC w PBST, a następnie osuszenia jej poprzez delikatne uderzenie o ręcznik papierowy. Następnie do każdego dołka należy dodać PBST z BSA i inkubować płytkę przez 30 minut. Pozwala to zablokować niespecyficzne miejsca wiązania białek.

Z każdego dołka usuń roztwór blokujący, energicznie odchylając płytkę nad zlewem, a następnie dodaj 100 µL znormowanego biotynilowanego monomeru przynęci do odpowiednich dołków. Inkubuj płytkę przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń próbki przynęci z płytki poprzez ponowne odchylenie jej nad zlewem i przemyj ją trzykrotnie buforem PBST.

Następnie po trzecim przemyciu osusz płytkę, delikatnie uderzając nią o blat. Do każdej studni dodaj 100 µL znormalizowanego konstruktu przynęty pentamerowej i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po godzinie przemyj płytkę ponownie trzy razy buforem PBST, a na koniec raz samym buforem PBS.

Na koniec do każdej studzienki dodaj 60 µL roztworu nitrous seven i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny lub najlepiej inkubuj płytki przez 16 godzin w temperaturze 4 °C. Następnego dnia pozytywne interakcje zmienią kolor na czerwony. Wykonaj zdjęcie płytki w celu dokumentacji wizualnej, a następnie zmierz ilościowo reakcje przy absorbancji 485 nm przy użyciu czytnika płytek.

Około 10 minut po rozpoczęciu reakcji przesiewowej AveXis zaobserwowano zmianę barwy z żółtej na czerwoną zarówno w kontroli wychwytu ofiary pośredniczonego przez przeciwciała, jak i w interakcji kontrolnej dodatniej. Zmiana barwy ta świadczy o hydrolizie podłoża azotynowego. W tej skali czasowej można zaobserwować niektóre interakcje dodatnie, jednak większość z nich pojawiła się po kilku godzinach.

Zazwyczaj obserwuje się odsetek trafień na poziomie około 0,4 do 0,6% wyników dodatnich. Po przygotowaniu bibliotek białek część przesiewowa tej techniki może zostać przeprowadzona szybko. Po zidentyfikowaniu oddziaływania możliwe jest przesiewanie nawet 12 płytek w ciągu jednego dnia.

Najważniejszym kolejnym krokiem jest po pierwsze wykazanie, że oddziaływanie można powtórzyć, wykorzystując świeże, niezależne preparaty białek. Po drugie, zawsze sprawdzamy, czy oddziaływanie jest niezależne od orientacji białka przynęty (bait) i białka ofiary (prey), czyli czy może ono zachodzić wzajemnie. Wiąże się to z klonowaniem domen z wektora przynęty do wektora ofiary i odwrotnie.

Interakcje, które można powtórzyć i które wykazują wzajemność, są uznawane za wiarygodne i zawsze okazywały się być dodatnie. W celu dodatkowej walidacji zidentyfikowanych interakcji wykorzystujemy techniki takie jak powierzchniowy rezonans plazmonowy. Co istotne, pozwala to na wykazanie, że dwa oczyszczone komponenty mogą oddziaływać bezpośrednio, a także udowodnić, że wiązanie ulega nasyceniu, a zatem jest swoiste.