Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Niniejszy film opisuje procedurę śledzenia zdarzeń sygnalizacyjnych receptorów limfocytów T z wykorzystaniem symultanicznej akwizycji dwukanałowej. W mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) limfocyty T są najpierw transfektowane plazmidem kodującym ZAP 70 z tagiem GFP, a następnie przygotowywana jest wsparta szklaną podstawką lipidowa warstwa dwuwarstwowa, zawierająca zakotwiczone w lipidach kompleksy MHC z peptydami, cząsteczki adhezyjne oraz cząsteczki kostymulujące.

Limfocyty T przetransfekowane białkiem ZAP 70 są dodawane do dwuwarstwy w momencie, gdy receptory limfocytów T są angażowane przez kompleksy peptyd-MHC. Powiązane z receptorem limfocytów T łańcuchy CD3 są fosforylowane przez kinazę LCK z rodziny SARC, co prowadzi do rekrutacji kinazy ZAP 70 z cytoplazmy. Następnie receptor limfocytów T jest znakowany fluorescencyjnie i przeprowadzane jest obrazowanie, podczas którego komórki są zanurzone w medium o niższym współczynniku załamania światła niż szkło nakrywowe i oświetlane wiązką lasera pod kątem powodującym całkowite wewnętrzne odbicie.

Powoduje to powstanie fali ewanescentnej na granicy szkło-woda, która zanika wykładniczo w ośrodku, co pozwala na uzyskanie głębokości penetracji od 100 do 200 nanometrów. W związku z tym wzbudzeniu ulegają jedynie fluorofory znajdujące się w błonie plazmatycznej lub w jej bezpośrednim sąsiedztwie. Analiza otrzymanych obrazów wykazuje, że sygnalizacja zachodzi w mikroklastrach receptorów limfocytów T.

Główną zaletą mikroskopii TIRF lub konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej jest uzyskanie lepszej rozdzielczości, dzięki której łatwo można zwizualizować klastry sygnałowe lub kompleksy sygnałowe, takie jak mikroklastry TCR. Travis Crites i Chen, obaj postdoktoranci w moim laboratorium, zademonstrują sposób transfekcji pierwotnych limfocytów T myszy przy użyciu technologii Maximi Nucleofector, a następnie ich obrazowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkownym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) po stymulacji szklaną warstwą lipidową zawierającą antygen.

Metoda ta była szeroko stosowana do badania sygnalizacji w różnych komórkach odpornościowych, w tym limfocytach T, limfocytach B, komórkach NK oraz komórkach tuczowych. Metoda ta ma szerokie zastosowanie i może być wykorzystywana do badania większości układów receptorowych w komórkach ssaków, szczególnie gdy sygnalizacja zachodzi w klastrach. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą początkowo napotkać trudności, ponieważ limfocyty T są bardzo trudne do transfekcji.

Ponadto wymagana jest precyzyjna koordynacja, aby żywotność limfocytów T i wydajność transfekcji, jakość bilayera oraz ustawienie mikroskopu spełniały odpowiednie standardy. Pierwszym krokiem tej procedury jest transfekcja naiwnych lub aktywowanych in vitro pierwotnych limfocytów T plazmidami ekspresyjnymi i kodującymi cząsteczkami sygnałowymi znakowanymi GFP przy użyciu zestawu AM maxa mouse T-cell nucleo effector kit. Wszystkie limfocyty T wykorzystane w tej badaniu wykaziły ekspresję A-N-D-T-C-R, który rozpoznaje peptyd MCC znajdujący się w cząsteczce MHC IE myszy K. Procedura transfekcji przedstawiona w niniejszym materiale jest przeprowadzana zgodnie z zaleceniami producenta.

Przedstawiono jednak kilka wskazówek, które zwiększają żywotność limfocytów T po transfekcji. Zarówno żywotność, jak i wydajność transfekcji są wyższe w przypadku limfocytów T aktywowanych in vitro niż w przypadku komórek naiwnych, dlatego niniejszy protokół zakłada użycie limfocytów T aktywowanych in vitro przed rozpoczęciem procedury. Dla każdej transfekcji należy przygotować dwa mililitry uzupełnionego medium dla limfocytów T, łącząc w probówce o pojemności dwóch mililitrów 1,9 mililitra medium dostarczonego w zestawie, 20 µL komponentu A, 20 µL komponentu B oraz 100 µL płodowej surowicy bydlęcej.

Przenieś dwa mililitry pożywki do każdej studni płytki 12-dołkowej. Umieść płytkę w inkubatorze z nawilżaczem w temperaturze 37 °C na co najmniej godzinę, aby pożywka się ustabilizowała; resuspensja przetransfekowanych komórek w pożywce zimnej lub o pH innym niż 7,2 doprowadzi do śmierci komórek. Aby przygotować mieszaninę do transfekcji, połącz 82 µL roztworu NucleoEffector dla limfocytów T myszy z 18 µL suplementu 2 oraz 5 µg wolnego od endotoksyn plazmidowego DNA o stężeniu nie niższym niż 0,5 µg/µL i wymieszaj dokładnie poprzez delikatne opukiwanie.

Przenieś od pięciu do 10 milionów komórek do probówki do wirowania o pojemności 15 mililitrów i wiruj z prędkością 75 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu użyj aspiratora próżniowego, aby usunąć jak największą ilość supernatantu. Resuspenduj pellet komórkowy w mieszaninie do transfekcji, delikatnie i powoli aspirując pellet od trzech do czterech razy, aż do całkowitego usunięcia dużych skupisk komórek. Za pomocą pipety ostrożnie przenieś zawiesinę do certyfikowanego elektropora amaxa vete, upewniając się, że wewnątrz nie ma pęcherzyków powietrza.

Wybierz program efektora jądrowego qve X 0 0 1 na urządzeniu do efektorów jądrowych. Włóż vete do uchwytu Q vete i naciśnij przycisk, aby zastosować wybrany program. Następnie niezwłocznie przenieś vete oraz wstępnie wyrównane podłożem pożywkę do dygestorium.

Za pomocą dołączonej plastikowej pipety dodaj około 500 µL uprzednio zrównoważonego medium do dołka. Następnie dodaj zawiesinę komórkową do medium w płytce, dozując ją kropla po kropli.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez cztery godziny, aby umożliwić niski poziom ekspresji białek znakowanych GFP oraz zminimalizować występowanie artefaktów wynikających z nadekspresji. W tej sekcji opisano metodę ustawiania mikroskopu do jednoczesnego obrazowania dwukanałowego przed włączeniem wszystkich komponentów mikroskopu. Uruchom komputer oraz oprogramowanie.

Następnie należy upewnić się, że wszystkie komponenty sprzętowe zostały rozpoznane przez oprogramowanie. Ponieważ oprogramowanie uruchomiło się bez żadnych komunikatów o błędach, wszystkie komponenty zostały wykryte. Rozcieńczyć 1 µL roztworu podrozdzielczego.

Przenieś fluorescencyjne mikrosfery wielobarwne Flores do 2 ml PBS, aby przygotować standard kolokalizacji. Następnie dodaj 0,25 ml zawiesiny mikrosfer do każdej studni ośmiostudzienkowego systemu szkiełek podstawkowych z komorami firmy Lab Tech. Umieść system szkiełek komorowych na platformie nad obiektywem.

Następnie ustaw ostrość na kulek absorbujące przy szybce w podglądzie na żywo. Lewy panel przedstawia kanał, w którym widoczne będą komórki przetransfekowane GFP. Prawy panel będzie wyświetlać znakowany TCR podczas eksperymentów z obrazowaniem żywych komórek.

Używając regulacji Y w układzie XY, Z wprowadzenia światłowodu, dostosuj pozycję wiązki laserowej tak, aby wiązka wychodziła z obiektywu i była rzutowana na sufit. Ważne jest, aby wykonać tę czynność, gdy obiektyw znajduje się w pozycji, w której płaszczyzna szkła jest w ogniskowej. Jeśli wiązka na suficie jest rozproszona, oznacza to, że wiązka nie jest skolonimowana.

Wyreguluj mikrometr w osi Z, aby uzyskać pełną kolimację dla każdej z linii laserowych używanych w eksperymencie. Następnie, korzystając z miernika mocy lasera, ustaw moc lasera w zakresie od 20 do 30 µW dla każdego kanału. Limfocyty T są niezwykle wrażliwe na promieniowanie laserowe, dlatego całkowita moc oświetlenia jest ograniczona do łącznie 50 µW.

W następnym kroku należy ustawić kąt dla darni. Obróć mikrometr wyrównania osi Y w module wprowadzania światłowodowego, aby przesunąć wiązkę w dół od sufitu, aż jej kąt w stosunku do osi optycznej obiektywów zbliży się do 90 stopni.

Po osiągnięciu kąta krytycznego dla całkowitego wewnętrznego odbicia światło lasera przestanie opuszczać obiektyw. Aby ocenić, czy uzyskano odpowiednie ustawienie tzw. dywanu (turf alignment), należy przesuwać ostrość w górę i w dół przez płaszczyznę szkiełka nakrywowego. Zauważmy tutaj, że gdy kulek zaabsorbowanych na powierzchni brakuje w płaszczyźnie ostrości, wiele kulek można dostrzec dryfujących w roztworze. Aby uzyskać prawidłowe ustawienie dywanu, konieczne jest zwiększenie kąta wiązki względem obiektywu.

Wraz ze zwiększaniem kąta wiązki, kuleczki pływające w pobliżu powierzchni zaczynają znikać, a intensywność kuleczek zaabsorbowanych na granicy faz wzrasta. Obecnie, gdy kuleczki zaabsorbowane na granicy faz zostaną wyprowadzone poza obszar ostrości, żadne kuleczki pływające w roztworze nie pozostają widoczne. W tym momencie układ jest prawidłowo wyrównany, ponieważ jedynie kuleczki zaabsorbowane na szkiełku nakrywce mogą znajdować się w ostrości.

Następnie, aby dopasować do siebie czerwony i zielony kanał fluorescencji, ustaw ostrość na kuleczki i porównaj położenie charakterystycznych elementów na obrazach uzyskanych w obu kanałach. Za pomocą mikrometrycznych śrub X i Y na jednym ze statywów kamer przesuń kuleczki tak, aby ich względne położenie było jak najbliższe. Zwróć uwagę na jasną kuleczkę w lewym dolnym kwadrancie obu obrazów, aby zapewnić wyrównanie przestrzenne między dwoma kanałami.

Tę strukturę ustawia się w tej samej pozycji względnej na obu obrazach. Należy zarejestrować i zapisać obrazy z obu kanałów. Obrazy te posłużą jako standard kolokalizacji do wyrównania obu kanałów.

Przykład takiego dopasowania przedstawiono tutaj przed wykonaniem wyrównania. Jeden z kanałów jest obrócony względem drugiego, co widać na tym obrazie, na którym nałożono na siebie obrazy z dwóch kanałów kulek o rozdzielczości poniżej limitu dyfrakcyjnego. Po wprowadzeniu korekt obrazy są wyrównane, jak pokazano tutaj.

Jakość dopasowania można dodatkowo zweryfikować, porównując obrazy żywych komórek przetransfekowanych GFP. Zwróć uwagę, że podium Laila z obu kanałów jest idealnie wyrównane. Następuje to po dopasowaniu dwóch obrazów przy użyciu kalibracji ustanowionej za pomocą fluorescencyjnych mikrokulek.

Po przygotowaniu mikroskopu przygotowuje się komory przepływowe zawierające wsparte na szkle dwuwarstwy lipidowe prezentujące antygen, a następnie wykonuje się turf M, aby w pierwszej kolejności zwizualizować wchodzące w interakcję z podłożem transfektowane limfocyty T. Zgodnie z protokołem opisanym przez Anę i Dustina, montuje się komorę przepływową z płaskimi dwuwarstwami lipidowymi utworzonymi na szklanym nakryciu zawierającym lipidy NI NTA, cząsteczkę adhezyjną ICAM-1 oraz kompleksy peptydowo-MHC. IEFK obciążone MCC są włączane do dwuwarstwy za pomocą znaczników histydynowych.

Wprowadzono cząsteczkę kostymulującą CD 80. Wykorzystując kotwicę GPI, umieść komorkę przepływową na stoliku mikroskopu i ustabilizuj ją, mocując komorę do płyty adapterowej na stoliku mikroskopu za pomocą pręta napinającego w celu jej unieruchomienia. Następnie zamocuj dostarczony przez producenta element grzejny do komorki przepływowej, aby kontrolować jej temperaturę.

Ustaw obiektyw nad warstwą lipidową (bilayer) i wyostrz obraz płaszczyzny tej warstwy, aby umożliwić ogrzewanie obiektywu oraz komory przepływowej; włącz grzałki komory przepływowej i obiektywu, aby doprowadzić temperaturę w komorze do 37 °C. Po czterech godzinach inkubacji przenieś przetransfekowane limfocyty T do probówki o pojemności 15 ml i odwirowuj z prędkością 80 ×g. Resuspenduj komórki w 300 µL buforu H-B-S-B-S-A. Następnie dodaj przeciwciało H 57 FAB lub fragment zmienny pojedynczego łańcucha H 57 w celu znakowania TCR do stężenia końcowego 10 µg/ml dla fab lub 20 µg/ml dla fragmentu zmiennego pojedynczego łańcucha.

Przenieś komórki do probówki typu Falcon o pojemności pięciu mililitrów. Następnie, używając strzykawki z końcówką 1 ml, wstrzyknij komórki do komory przepływowej poprzez zawór trójdrożny. Skonfiguruj warunki obrazowania tak, aby dwukanałowa akwizycja na żywo wyświetlała podgląd kanałów TCR i GFP, a następnie znajdź pole z komórkami transfekowanymi.

Ze względu na różnice w intensywności sygnałów TCR i GFP, skalowanie obrazów może wymagać korekty w czasie rzeczywistym, aby umożliwić wizualizację komórek w obu kanałach. Podobnie jak w tym przypadku, potwierdź oświetlenie powierzchniowe (turf illumination), przesuwając płaszczyznę szklaną w górę w celu wykrycia ewentualnego barwienia bocznych błon. Jeśli boczne błony nie wchodzą w ognisko, oznacza to, że ustawienie powierzchniowe jest prawidłowe.

W tym podglądzie na żywo barwienie błony bocznej jest widoczne zarówno w płaszczyźnie szkiełka nakrywki, jak i w momencie, gdy szkiełko nakrywki zostaje przesunięte poza obszar ostrości, aby uzyskać właściwe ustawienie mikroskopu w trybie turf. Kąt lasera względem obiektywu zostaje zwiększony, a błona boczna traci ostrość. Rozpocznij przechwytywanie pojedynczych obrazów oraz sekwencji poklatkowych z interwałem 10 s.

Przez pięć minut komórki inkubowano na dwuwarstwach szklanych i INTA zawierających sześć cząsteczek na mikrometr kwadratowy peptydu z tagiem His IEFK, 100 cząsteczek na mikrometr kwadratowy ICAM-1 z tagiem His sprzężonego z Alexa 647 oraz 100 cząsteczek na mikrometr kwadratowy CD80 zakotwiczonego w GPI. Przeprowadzono jednoczesną akwizycję obrazów dwukanałowych za pomocą mikroskopii TURF w stałej obecności fragmentu FAB H57 sprzężonego z Alexa 546.

Aby zabarwić TCR, komórki obrazowano do jednej godziny po pierwszym kontakcie z warstwą dwuskładnikową. Liczbę skupisk ZAP 70 na komórkę analizowano przy użyciu zautomatyzowanego oprogramowania do liczenia skupisk. W każdym przypadku przeanalizowano co najmniej 40 komórek.

Załadowane peptydy są wskazane na wstawce. ICAM 1 odnosi się do komórek na dwuwarstwach zawierających 100 cząsteczek na mikrometr kwadratowy sprzężonego Alexa 647 z His-tagiem ICAM 1, jak pokazano na rycinie. Sygnalizacja zależna od Zap 70 zachodzi w mikroskupiskach TCR i tylko w odpowiedzi na ligandy agonistyczne, co można zaobserwować w tym filmie, zarejestrowanym w tempie 10 sekund na klatkę.

Sygnalizacja TCR w odpowiedzi na peptydy agonistyczne jest podtrzymywana przez ciągłe tworzenie mikroklastrów TCR na obrzeżach obszaru kontaktu, które rekrutują ZAP 70. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak transfekować pierwotne limfocyty T przy użyciu technologii maxa nuclear affection oraz jak prawidłowo obrazować rekrutację cząsteczek sygnałowych GFPT do mikroklastrów TCR za pomocą mikroskopii turf. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura może zająć siedem godzin.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby obchodzić się z komórkami pierwotnymi bardzo delikatnie. Im zdrowsze będą komórki na każdym etapie eksperymentu, tym wyższa będzie wydajność transfekcji i tym więcej komórek uda się uchwycić podczas obrazowania. Limfocyty T są bardzo ruchliwe, w efekcie czego sekwencyjne obrazowanie kanału TCR i GFP powoduje, że dwa obrazy nie pokrywają się idealnie ze względu na przemieszczanie się mikroklastrów TCR i samych komórek.

Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy dwukanałowy mikroskop turf do jednoczesnej akwizycji obrazu.