Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zapewnienie standaryzowanego monitorowania zachowania in vivo komórek macierzystych przeszczepionych do mózgu myszy. Osiąga się to poprzez uprzednie znakowanie pochodzących z szpiku kostnego komórek stropowych, wykazujących koekspresję EGFP i lucyferazy, fluorescencyjnymi cząstkami tlenku żelaza o rozmiarach mikronowych. Drugim krokiem jest odpowiednie wstrzyknięcie znakowanych MPIO komórek BMC do tkanki mózgowej myszy.

Następnie, przeżywalność i lokalizacja przeszczepów komórkowych są monitorowane nieinwazyjnie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego oraz obrazowania rezonansem magnetycznym. Ostatnim krokiem jest walidacja wyników obrazowania in vivo przy użyciu pośmiertnej analizy histologicznej. Metody te mogą dostarczyć informacji na temat zachowania komórek macierzystych po transplantacji do mózgu myszy, ale mogą być one również zastosowane w innych układach, takich jak organizmy modelowe oraz badania nad chorobami.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy postępowania ze zwierzętami są trudne do opanowania ze względu na trudność wykonania wstrzyknięć dożylnych i wewnątrzczaszkowych oraz związane z nimi ryzyka dla przeżywalności zwierząt. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 75 times 10 to the six nanocząsteczek tlenku żelaza (glacial blue) do subkonfluencyjnej hodowli komórek. Inkubuj je przez kolejne 16 hours, aby umożliwić pobieranie cząsteczek drogą endocytozy, a następnie wypłucz pozostałe cząsteczki.

Pozostaw komórki do wzrostu przez kolejne 24 godziny, aby uzyskać odpowiednią konfluencję oraz jednorodny rozkład G-B-M-P-I-O. Następnie, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną, dokonaj wizualnej walidacji poboru cząsteczek poprzez obliczenie stosunku komórek pozytywnych pod kątem EGFP i G-B-M-P-I-O do całkowitej liczby komórek pozytywnych pod kątem EGFP. Następnie dwukrotnie przemyj komórki BMSC lucyferaza EGFP znakowane G-B-M-P-I-O za pomocą 10 mililitrów.

Potraktuj komórki roztworem PBS, a następnie tripsyną z EDTA i zbierz je po zakończeniu inkubacji. Następnie przemyj komórki i resuspenduj je w PBS do końcowego stężenia 133 × 10⁶ komórek/ml. Na koniec przechowuj komórki w lodzie do momentu transplantacji.

W tej procedurze znieczul mysz poprzez podanie dojamistrzynne mieszaniny ketaminy w dawce 80 mg/kg oraz ksylazyny w dawce 16 mg/kg. Odczekaj pięć minut, aż mysz zaśnie, a następnie ogól jej głowę, aby umożliwić sterylne manipulacje. Następnie umieść mysz w podstawie stereotaktycznej i zdezynfekuj skórę alkoholem.

Następnie na oczy zwierzęcia nałożyć maść, aby zapobiec ich odwodnieniu. Wykonać cięcie w linii środkowej skóry głowy, aby odsłonić czaszkę i umożliwić dotarcie do hipokampa. Za pomocą wiertła dentystycznego wywiercić otwór w czaszce w odległości 2 mm w kierunku tylnym i 2 mm w kierunku bocznym.

Na tym etapie krótko wymieszaj zawiesinę komórkową w wirówce wortex, a następnie pobierz ją do strzykawki. Następnie wprowadź igłę strzykawki na głębokość 2,5 mm pod oponę twardą i odczekaj jedną minutę w celu wyrównania ciśnienia. Po minucie wycofaj igłę do pozycji 2 mm pod oponą twardą.

Następnie wstrzyknij 3 µL zawiesiny komórkowej za pomocą zautomatyzowanej pompy do mikroiniekcji z prędkością 0,70 µL/min. Po iniekcji odczekaj dodatkowe pięć minut, aby zapobiec cofaniu się wstrzykniętej zawiesiny komórkowej. Następnie powoli wycofaj igłę.

Następnie zdezynfekuj brzegi skóry, a potem zaszyj ranę. Wstrzyknij podskórnie 300 µL 0,9% roztworu chlorku sodu, aby zapobiec odwodnieniu. Na koniec umieść mysz pod lampą grzewczą, aby umożliwić wybudzenie z narkozy przed wykonaniem obrazowania bioluminescencyjnego.

Uśpij mysz mieszaniną 3% izofluranu i tlenu. Następnie umieść mysz w obrazowniku fotonowym. Zmniejsz poziom znieczulenia, regulując stężenie izofluranu do 1,5%. Następnie wstrzyknij d-lucyferynę dożylnie w dawce 150 mg/kg masy ciała.

Nabywaj obraz przez pięć minut, korzystając z oprogramowania photo vision. Następnie przeprowadź przetwarzanie obrazu za pomocą oprogramowania M three vision i zmierz natężenie zaobserwowanego sygnału, wykorzystując stałe obszary zainteresowania (ROI). Aby wykonać obrazowanie rezonansem magnetycznym, znieczul mysz 3% ISO fluorine w mieszaninie tlenu i tlenku azotu.

Następnie umieść mysz w stabilizatorze poziomego systemu MR 9,4 Tesla. Zmniejsz poziom anestezji, ustawiając stężenie izofluranu na 1%. Następnie nałóż maść do oczu myszy, aby zapobiec ich wysuszeniu. Po tym użyj sondy rektalnej do monitorowania temperatury ciała.

Następnie umieść czujnik pod brzuchem myszy, aby monitorować częstotliwość oddechów. Utrzymuj częstotliwość oddechów na poziomie 110 ± 10 razy na minutę oraz utrzymuj temperaturę ciała na stałym poziomie w wąskim zakresie 37 ± 0,5 °C. Następnie umieść powierzchniową cewkę RF na głowie myszy.

Ustaw mysz w środku magnesu. Następnie otwórz program ParaVision 5.1. Ustaw parametry sekwencji zgodnie z załączonym manuskryptem. Następnie wykonaj zestaw 10 obrazów w płaszczyźnie koronarnej w technice spin-echo ważonej T2, aby uzyskać specyficzne informacje anatomiczne.

Wykonano obrazy ważone gradientem echa two-gwiazdkowego NT w celu zbadania migracji komórek macierzystych z rozdzielczością w płaszczyźnie 70 µm². Na tym etapie uśmiercono mysz i wyekstrahowano mózg. Tkankę mózgową utrwalono w temperaturze pokojowej w 4%paraldehydzie w PBS przez dwie godziny.

Po dwóch godzinach odwodnić tkankę mózgową, umieszczając ją w roztworach sacharozy o różnych stężeniach w temperaturze 4 °C. Następnego dnia zamrozić tkankę mózgową w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu wykonania skrawków.

Przygotuj skrawki tkanki mózgu o grubości 10 µm przy użyciu kriostatu. Następnie, pod mikroskopem fluorescencyjnym, sprawdź niebarwione skrawki kriogeniczne pod kątem niebieskiej fluorescencji cząsteczek G-B-M-P-I-O oraz zielonej fluorescencji komórek wykazujących ekspresję EGFP. Następnie sprawdź niebarwione skrawki kriogeniczne pod kątem zielono-czerwonej fluorescencji tła pochodzącej z komórek zapalnych.

Opisana procedura znakowania MPIO glacial blue skutkuje wysoce efektywnym znakowaniem BMSC, komórek luciferase EGFP, co można łatwo potwierdzić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Następnie, po przeszczepieniu G-B-M-P-I-O, znakowanych BMSC oraz komórek luciferase EGFP do OUN myszy, przeżywalność przeszczepu komórkowego można monitorować za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo w oparciu o aktywność lucyferazy. Dodatkowo, dokładną lokalizację przeszczepionych komórek można monitorować za pomocą obrazowania rezonansu magnetycznego in vivo w oparciu o zawartość żelaza w MPIO glacial blue.

Wreszcie analiza histologiczna potwierdza wyniki uzyskane za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego oraz obrazowania rezonansem magnetycznym. Stabilne przeżycie potwierdzono poprzez trwałą ekspresję EGFP w czasie po jej rozwinięciu. Technika ta otworzyła badaczom w dziedzinie obrazowania molekularnego drogę do badania zdarzeń komórkowych i molekularnych po transplantacji komórek macierzystych w różnych modelach zwierzęcych chorób neurodegeneracyjnych.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób przeprowadzania obrazowania molekularnego z zastosowaniem bioluminescencji i obrazowania rezonansem magnetycznym, a także odpowiednią walidację wyników in vivo poprzez pośmiertną ocenę histologiczną.