Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u mięczaka Aplysia
15 lipca 2012
Prezentujemy sposób jednoczesnego monitorowania zmian stężenia wewnątrzkomórkowego wolnego wapnia oraz skuteczności synaptycznej w preparacie zwojowym Aplysia. Obrazujemy wapń wewnątrzkomórkowy z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Calcium Orange, a transmisję synaptyczną indukujemy i monitorujemy za pomocą elektrod ostrych (wewnątrzkomórkowych).
Wewnątrzkomórkowy wapń uznaje się za istotny element wielu mechanizmów plastyczności synaptycznej. Hipotezy te można zweryfikować poprzez jednoczesne monitorowanie zmian poziomu wapnia oraz zmian w skuteczności synaptycznej. W niniejszym materiale demonstrujemy, w jaki sposób można to osiągnąć, łącząc obrazowanie wapnia z rejestracją wewnątrzkomórkową.
Nasze eksperymenty są przeprowadzane na zwoju mięczaka Aplysia Cahora. Preparat ten posiada szereg zalet, takich jak duże, zidentyfikowane neurony, niskie temperatury naturalne dla apia oraz wolne sygnały ułatwiające obrazowanie, jednak zaprezentowane przez nas ogólne techniki można z łatwością przenieść na inne systemy. Witam, nazywam się Colin Evans i pracuję w laboratorium Elizabeth Cropper w Departamencie Neuronauki Fishburg oraz w Instytucie Mózgu Freedman w Mount Sinai School of Medicine w Nowym Jorku.
Dzisiaj zaprezentujemy jednoczesne obrazowanie zmian w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia oraz skuteczności synaptycznej w zwoju jamnym mięczaka Aplysia cahora. W celu wykrycia wapnia wewnątrzkomórkowego, w neuron presynaptyczny wstrzykniemy barwnik wskaźnikowy wapnia, calcium orange, który przenika przez błony komórkowe. Następnie preparat zostanie przeniesiony pod mikroskop, a neurony presynaptyczne i postsynaptyczne zostaną przebite ostrymi elektrodami.
Powtarzająca się stymulacja presynaptyczna prowadzi do wzmocnienia odpowiedzi postsynaptycznej, widocznej jako wzrost potencjału postsynaptycznego lub amplitudy PSP. Pomiar sygnału fluorescencyjnego barwnika wskaźnikowego wapnia pozwoli nam wykryć jednoczesne zmiany wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w terminalu presynaptycznym. Aby rozpocząć, należy znieczulić dorosłe zwierzę o masie około 150 g, wstrzykując 75 ml izotonicznego roztworu chlorku magnezu, przytwierdzić znieczulone zwierzę do naczynia pokrytego woskiem, a następnie za pomocą pęsety chirurgicznej i nożyczek wykonać nacięcie w stopie zwierzęcia i odsłonić masę policzkową.
Zwoje przełykowe znajdują się po stronie brzusznej masy przełykowej i składają się z dwóch połączonych półzwojów. Zawierają one kilkaset neuronów, które wraz z neuronami w innych zwojach przyczyniają się do generowania i kontrolowania zachowań pokarmowych zwierzęcia. Ostrożnie uwolnij zwoje, przecinając wszystkie nerwy przełykowe za pomocą cienkich nożyczek, a następnie usuń je ze zwierzęcia.
Następnie przypnij uwolniony zwoj do dna naczynia z powłoką sil-guard wypełnionego sztuczną wodą morską. Zwoj jest owinięty osłoną z tkanki łącznej, którą należy usunąć, aby odsłonić poszczególne neurony. Używając pęsety precyzyjnej, nożyc irydowych i zachowując szczególną ostrożność, odetnij tę osłonę.
Aby uniknąć uszkodzenia neuronów, należy ustabilizować zwoje pozaczaszkowe za pomocą szpilek w odstępach około 15 minut, ponieważ jakikolwiek ruch będzie problematyczny podczas obrazowania. W celu przygotowania ostrych elektrod do rejestracji wewnątrzkomórkowej i wstrzykiwania barwnika, należy wyciągnąć rurki kapilary za pomocą mikro-wyciągarki elektrod. Stosujemy cienkościenne włókna szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1 mm.
Elektrody rejestrujące powinny mieć oporność około 10 MΩ po napełnieniu 3 M octanu potasu, dlatego odpowiednio ustawiamy wyciągacz do przygotowania elektrod D. Zanurz tył wyciągniętej elektrody w 10 mM roztworze barwnika Calcium Orange; działanie kapilarne wzdłuż szklanego włókna wewnątrz elektrody wciągnie barwnik do czubka, a następnie wypełnij elektrodę od tyłu 200 mM chlorkiem potasu, aby zapewnić dobry kontakt elektryczny. Używamy specjalnie zbudowanego urządzenia do polerowania (bleach), aby poprawić właściwości elektrody i obniżyć oporność elektrody rejestrującej do około 5 MΩ.
Elektrodę utrzymuje się pod kątem 45 stopni w strumieniu zawiesiny tlenku glinu. Dodanie chlorku sodu do zawiesiny i podłączenie omometru umożliwia monitorowanie rezystancji elektrody. Podczas procesu skosowania przenosimy naczynie zawierające zwichnięte zwoje buckle na stanowisko do elektrofizjologii i lokalizujemy interesujące nas neurony, nakłuwając je elektrodami i weryfikując ich tożsamość.
Aby przygotować neuron do obrazowania wapnia, najpierw wprowadzamy wypełnioną barwnikiem elektrodę do somy komórki i wprowadzamy barwnik drogą elektroforetyczną, stosując 30-minutowe impulsy prądu hiperpolaryzującego o natężeniu 15 nano amp. W miarę jak D calcium orange wnika do komórki, soma nabierze bladego różowego koloru. Następnie ostrożnie wycofujemy elektrody rejestrujące i pozostawiamy preparat na co najmniej 30 minut, aby barwnik mógł zdyfundować do cienkich wypustek neuronu.
Następnie przenieś szalkę z preparatem pod mikroskop fluorescencyjny. Używamy obiektywu z zanurzeniem w wodzie o powiększeniu 10x i NA 0,3 w mikroskopie z pionową platformą stałą, w którym ostrzenie odbywa się poprzez przesuwanie obiektywu, a nie stolika. Ułatwia to montaż manipulatorów.
Dla elektrod rejestrujących należy wybrać odpowiedni blok filtrów. Blok trzech filtrów SI zapewni prawidłowe filtry wzbudzenia i emisji dla barwnika calcium orange; należy dostosować parametry kamery oraz natężenie oświetlenia za pomocą filtrów neutralnych i przysłony pola. Zwiększenie ilości światła pozwoli zredukować szum, ale może potencjalnie doprowadzić do wybielenia preparatu.
Kamera CCD CoolSnap może rejestrować pole widzenia o rozmiarach 500 na 300 pikseli przy częstotliwości klatek wynoszącej około 30 klatek na sekundę oraz z dobrym stosunkiem sygnału do szumu. Należy zminimalizować oświetlenie neuronów fil, utrzymując migawkę źródeł światła w pozycji zamkniętej, gdy tylko jest to możliwe. W oprogramowaniu do obrazowania należy zaznaczyć obszary zainteresowania (ROI).
Obszary te określają miejsca, w których oprogramowanie będzie wykonywać pomiary intensywności. Zazwyczaj obrazujemy gałęzie pierwotne, wtórne i trzeciorzędne neuronu presynaptycznego. Umieść dodatkowy ROI obok neuronu difi, aby uzyskać wartość tła, która zostanie później odjęta od wszystkich pozostałych punktów danych.
Do indukowania i monitorowania przekaźnictwa synaptycznego stosuje się elektrody do rejestracji wewnątrzkomórkowej w neuronach presynaptycznych i postsynaptycznych. Synchronizację między akwizycją danych elektrofizjologicznych a obrazowaniem można zapewnić, wykorzystując sygnał wyzwalający klatki (frame out trigger) kamery do uruchomienia oprogramowania do akwizycji danych. Innym sposobem zapewnienia synchronizacji jest zamontowanie diody LED w porcie kamery.
Ta dioda LED jest włączana na krótko na początku sesji rejestracji, co zapewnia znacznik synchronizacji. Podczas typowego eksperymentu wywołuje się potencjały czynnościowe w neuronie presynaptycznym poprzez wstrzyknięcie krótkich impulsów prądowych. W tym przykładzie przedstawiamy serię impulsów (burst) oraz odpowiadające im wzrosty sygnału wapniowego w celu przetestowania konkretnych hipotez.
Sygnał wapniowy może być manipulowany w celu określenia jego wpływu na przekaźnictwo synaptyczne. Na przykład leki, takie jak chelator wapnia EGTA, mogą być wstrzykiwane presynaptycznie lub podawane za pomocą systemu perfuzji. Dane analizuje się poprzez eksport z oprogramowania do obrazowania do pliku tekstowego, a następnie do oprogramowania wykorzystywanego do pozyskiwania danych elektrofizjologicznych, którym w naszym przypadku jest spike2 firmy Cambridge Electronic Design.
Używamy napisanego na zamówienie skryptu do wykresowania wartości intensywności ROI i odpowiadających im zmian potencjału błony oraz do ilościowego określenia zmian w sygnale wapniowym poprzez odjęcie sygnału tła uzyskanego z ROI tła i obliczenie względnej zmiany za pomocą przedstawionego równania. F zero to fluorescencja bezpośrednio przed stymulacją, a F to fluorescencja podczas stymulacji. Poniżej przedstawiamy wyniki eksperymentu, w którym obrazowano zmiany fluorescencji wapnia w zidentyfikowanym neuronie B 21.
Obszar, który obrazowano, wskazano w A; w B 1 wywołaliśmy serię impulsów (spikes) w B 21, co wywołało potencjały postsynaptyczne w B 8 oraz zmianę sygnału wapniowego. B 2 przedstawia efekt wstrzyknięcia chelatora wapnia EGTA; impulsy w B 21 nie wywołują już rozległych wzrostów fluorescencji wapnia, a amplituda potencjału postsynaptycznego ulega zmniejszeniu.
Podsumowując, zaprezentowaliśmy techniki, które można wykorzystać do jednoczesnego monitorowania wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia oraz oceny skuteczności przekaźnictwa synaptycznego. Techniki te wymagają jedynie skromnego wyposażenia w porównaniu do większości metod obrazowania funkcjonalnego, a ich opanowanie jest łatwe i szybkie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie demonstruje jednoczesne monitorowanie wewnątrzkomórkowego stężenia wolnego wapnia oraz wydajności synaptycznej w preparacie zwoju Aplysia. Dzięki zastosowaniu Calcium Orange do obrazowania oraz ostrych elektrod wewnątrzkomórkowych do pomiaru przewodnictwa synaptycznego, praca ta podkreśla zależność pomiędzy dynamiką wapnia a plastycznością synaptyczną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Plastyczność synaptyczna
- Obrazowanie wapnia
Wstęp
- Wewnątrzkomórkowy wapń odgrywa kluczową rolę w mechanizmach plastyczności synaptycznej.
- Jednoczesny monitoring poziomu wapnia i skuteczności synaptycznej może dostarczyć cennych informacji na temat tych mechanizmów.
- Preparat zrazu Aplysia oferuje istotne zalety w tego typu badaniach.
- Przedstawione techniki mogą zostać zaadaptowane do innych układów.
Cel badania
- Zbadanie roli wewnątrzkomórkowego wapnia w przekaźnictwie synaptycznym.
- Zaprezentowanie metody jednoczesnego monitorowania poziomu wapnia i skuteczności synaptycznej.
- Wykorzystanie Aplysia jako organizmu modelowego w badaniach z zakresu neuronauki.
Zastosowane metody
- Obrazowanie wapnia z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Calcium Orange.
- Rejestracja wewnątrzkomórkowa za pomocą mikroelektrod ostrych w celu monitorowania przekaźnictwa synaptycznego.
- Doświadczenia przeprowadzone na zwoju mięczaka Aplysia.
- Wykorzystanie dużych zidentyfikowanych neuronów dla zapewnienia efektywnego obrazowania.
Główne wyniki
- Pomyślny jednoczesny monitoring stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej.
- Wykazano związek między dynamiką wapnia a transmisją synaptyczną.
- Podkreślono zalety wykorzystania Aplysia w tego typu badaniach.
- Przedstawiono metodologię możliwą do zastosowania w innych systemach biologicznych.
Wnioski
- Wewnątrzkomórkowy poziom wapnia ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia plastyczności synaptycznej.
- Połączenie technik obrazowania i rejestracji jest skuteczne w badaniach nad neuronauką.
- Aplysia stanowi cenny model do badania mechanizmów synaptycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie mechanistycznego związku między wewnątrzkomórkową dynamiką wapnia a skutecznością synaptyczną ma kluczowe znaczenie dla minimalizacji ryzyka w walidacji celów w procesie odkrywania leków w neuronauce. Podejście to pozwala na uzyskanie pewności prognostycznej w zakresie modulacji szlaków poprzez bezpośrednie powiązanie kluczowego drugiego przekaźnika z funkcjonalnym wynikiem synaptycznym. Model zwoju ślimaka z rodzaju Aplysia dostarcza istotnego w kontekście chorób systemu do badania konserwowanych mechanizmów plastyczności, charakteryzującego się wysokim stosunkiem sygnału do szumu oraz stabilnością eksperymentalną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez badanie, czy modulacja wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia zmienia przekaźnictwo synaptyczne w zidentyfikowanych neuronach.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie funkcjonalnej walidacji celu poprzez jednoczesny pomiar przepływu jonów wapnia oraz zmian potencjału postsynaptycznego.
- Wartość prognostyczna: Wsparcie minimalizacji ryzyka mechanistycznego poprzez ustanowienie związków przyczynowo-skutkowych między sygnalizacją wapniową a skutecznością synaptyczną.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych z prawidłowym rozmieszczeniem kanałów jonowych i stabilnymi połączeniami synaptycznymi do przesiewu związków.
- Wynik ilościowy: Uzyskanie zmian intensywności fluorescencji bez konieczności stosowania pomiarów ratiometrycznych, skorelowanych z odczytami elektrofizjologicznymi dla analiz wysokotreściowych.
- Skalowalność: Wykorzystanie barwnika Calcium Orange o długiej długości fali, który nie wymaga koła filtrów, co upraszcza konfigurację obrazowania i zwiększa potencjalną wydajność.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Modeluje konserwatywne mechanizmy plastyczności synaptycznej, które mają zastosowanie w celach terapeutycznych zaburzeń neuropsychiatrycznych i neurodegeneracyjnych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy badanie mechanizmów w fazie odkrycia z walidacją przedkliniczną poprzez zestandaryzowane odczyty wapniowo-synaptyczne.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez ilościowe określenie, w jaki sposób modulacja celu wpływa zarówno na dynamikę wapnia, jak i funkcjonalny wynik synaptyczny.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, łącząc oddziaływanie z celem (poprzez modulację poziomu wapnia) z funkcjonalnymi skutkami fenotypowymi (skutecznością synaptyczną), co wspiera identyfikację związków wiodących oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez dotyczących zależnych od wapnia szlaków sygnalizacyjnych w plastyczności synaptycznej z wykorzystaniem bezpośredniej perturbacji i pomiaru z podwójnym odczytem.
- Przesiewanie: Umożliwienie standaryzacji testu dzięki stabilnym preparatom, barwnikom o niskiej fototoksyczności oraz zsynchronizowanemu gromadzeniu danych z elektrofizjologii i obrazowania.
- Analityka: Dostarczenie ilościowych pomiarów zmiennych zależnych (fluorescencja ΔF/F i amplituda PSP), które pozwalają na porównanie różnych warunków eksperymentalnych i traktowania związkami.
- Badania translacyjne: Wspieranie dopasowania biomarkerów poprzez korelację zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia z wydajnością synaptyczną w istotnym chorobowo modelu bezkręgowym zachowawczych mechanizmów neuronalnych.
- Zastosowania wdrożeniowe: Stworzenie wielokrotnego użytku platformy do badania zależnych od wapnia mechanizmów synaptycznych w wielu klasach celów i obszarach chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w relacjach między wapniem a synapsami.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji ładowania barwnika, przygotowania elektrod oraz synchronizacji za pomocą wyzwalacza LED.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów zaangażowanych w dysfunkcję synaptyczną.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o dwumodalne odczyty zaangażowania celu i efektu funkcjonalnego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach wewnątrzkomórkowej rejestracji mikroelektrodami ostrymi oraz obrazowania wapnia.
- Zależne od mikroskopii fluorescencyjnej umożliwiającej obrazowanie z częstotliwością 30 fps oraz zestawów elektrofizjologicznych z synchronizacją LED.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej zespołów zajmujących się obrazowaniem i elektrofizjologią w celu zsynchronizowanego pozyskiwania danych.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji przy przenoszeniu preparatu zwoju Aplysia do innych systemów modelowych o różnych rozmiarach neuronów lub właściwościach synaptycznych.
- Ograniczone przez brak możliwości wyznaczania bezwzględnych stężeń wapnia przy użyciu Calcium Orange ze względu na jego nieracjometryczną naturę oraz zmienne dyfuzji barwnika.
