Badania kliniczne i usuwanie rdzenia kręgowego w modelu mysim stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)

Witajcie, nazywam się Lar Turner. Jestem pracownikiem posydoktorskim w Katedrze Neurologii na Uniwersytecie w Ingham w Niemczech. Cześć, nazywam się Lin Gunda.

Jestem studentem medycyny i w tym laboratorium przygotowuję swoją pracę dyplomową. Dzisiaj zaprezentujemy testy kliniczne modelu SODG 93, modelu stwardnienia bocznego zanikowego u myszy. Ponadto zademonstrujemy test funkcji motorycznych za pomocą tak zwanego rotarod oraz dodatkowy test funkcji motorycznych z wykorzystaniem chwytania drutu, aby następnie przeprowadzić analizę immunologiczną.

Po testach funkcjonalnych myszy a s koniecznym zabiegiem jest usunięcie rdzenia kręgowego, nerwu STIC oraz mięśnia brzuchatego łydki. Chcemy szczegółowo przedstawić te procedury chirurgiczne, a na koniec zaprezentować przykładowe wyniki immunologiczne. Zanim jednak przejdziemy do nich, zacznijmy od testów klinicznych.

Jest to swobodnie poruszający się dziki typ MOE, który nie wykazuje żadnych objawów klinicznych, takich jak drżenia mięśniowe czy niedowłady w naszym systemie klasyfikacji klinicznej. Odpowiadałoby to ocenie czwartej. Jest to transgeniczny MOE z ALS.

We wczesnym stadium choroby występuje u niej silne drżenie prawej kończyny tylnej, co klasyfikuje ją jako wynik trzy E w skali SCORE. Silne nieprawidłowości w chodzie klasyfikują to zwierzę jako wynik dwa. Przeciąganie co najmniej jednej kończyny tylnej jest klasyfikowane jako kliniczny wynik jeden. W teście zawieszenia na drucie ocenia się ogólną siłę mięśniową kończyn. Każdą mysz umieszcza się na specjalnie wykonanym drucie i ostrożnie odwraca do góry nogami nad podłożem pokrytym słomą.

Po przeprowadzeniu treningu trzykrotnie w odstępach co najmniej 180 sekund zmierzono czas do upadku. Każdej myszy dano maksymalnie trzy próby utrzymania się na odwróconej pokrywce przez maksymalnie 180 sekund i zarejestrowano najdłuższy czas. W porównaniu do myszy typu białego drutu po prawej stronie, transgeniczna mysz z blaszkami po lewej jest bardzo słaba i spada z pokrywki przed osiągnięciem wartości maksymalnej.

Aparat Rotor rod służy do pomiaru koordynacji ruchowej, równowagi i zdolności uczenia się motorycznego. Dobry wynik wymaga wysokiego stopnia koordynacji sensoryczno-motorycznej. Urządzenie składa się z sterowanego komputerowo, napędzanego silnikiem obrotowego wrzeciona oraz pięciu torów dla pięciu myszy.

Błędy myszy są wykrywane automatycznie poprzez nacisk na dolną plastikową płytę. Po trzech kolejnych treningach trwających co najmniej 180 s przy stałej prędkości 15 obrotów na minutę, mierzony jest czas, przez który zwierzę jest w stanie utrzymać się na obracającym się rotatorze. Każde zwierzę przechodzi trzy próby, a zapisywany jest najdłuższy czas utrzymania się bez upadku.

Zdrowa mysz typu dzikiego po lewej stronie bez trudności przebiega na rotarodzie. W przeciwieństwie do niej, transgeniczna mysz αs mo po prawej stronie ma poważne problemy z samym utrzymaniem się na rotarodzie i po chwili ześlizguje się, co widać z perspektywy tyłu. Widoczne są poważne trudności w biegu lewej myszy retre.

W porównaniu ze zdrową myszą wire tap, zwierzę to nie nadąża za prędkością rotarodu i nie jest w stanie odpychać się w górę kończynami HIN. W celu przeprowadzenia analizy immunochemicznej rdzenia kręgowego zwierzęta muszą zostać uśpione. Bardzo ważne jest, aby zawsze ściśle przestrzegać lokalnych wytycznych dotyczących prawidłowego przeprowadzania doświadczeń na zwierzętach.

W tym kontekście, w tym bardzo uproszczonym przeglądzie kręgosłupa i otaczających go tkanek, przedstawiono główne struktury anatomiczne. Zwierzę zostanie ułożone na stronie brzusznej, a następnie przystąpimy do preparowania mięśni z worka grzbietowego. Po usunięciu tkanki mięśniowej uzyskamy dostęp do kręgosłupa, w którym znajduje się rdzeń kręgowy.

Po uśmierceniu zwierzęcia i przeprowadzeniu perfuzji roztworem zawierającym paraformaldehyd, można usunąć rdzeń kręgowy. Zwierzę umieszcza się na stole operacyjnym, a kończyny unieruchamia się po bokach w celu odsłonięcia grzbietowej strony myszy. Zwierzę zostaje zwilżone, aby wygładzić okrycie włosowe i ułatwić następujące nacięcie skóry.

W tym celu należy użyć ostrego skalpela. Należy starannie rozciągnąć skórę na obie strony. Aby ułatwić cięcie, należy przygotować mięsień kończyny.

Należy również naciąć skórę. Po wykonaniu nacięcia skóry jest ona delikatnie odsuwana na bok. Po usunięciu mięśni kończyny oraz nerwu kulszowego za pomocą pęsety, przechodzimy do odsłonięcia rdzenia kręgowego, a zwierzę umieszczamy na nowym stole operacyjnym.

W tym momencie można łatwo zidentyfikować czaszkę, szyję, mięśnie oraz kręgosłup. Po zidentyfikowaniu wszystkich tych struktur można przejść do kolejnego kroku. Należy usunąć mięśnie szyi oraz więzadło karkowe.

Należy uważać, aby nie naciąć tkanek zbyt głęboko i nie uszkodzić kręgosłupa. W kolejnym kroku mięśnie przykręgosłupowe są całkowicie usuwane w celu odsłonięcia kręgosłupa. Aby uzyskać dostęp do kolumny kręgosłupa, konieczne jest wykonanie kilku ektomii.

Zaczynamy od odcinka szyjnego kręgosłupa, w tym od stawu atlanto-potylicznego. Aby przeprowadzić laminektomię, musimy przeciąć łuk kręgowy, by móc usunąć wszystkie wyrostki kręgowe z trzonu kręgu. Jak wyjaśniono wcześniej, laminektomia rozpoczyna się od przecięcia łuków kręgowych.

Następnie można odsunąć błonę. Ponownie należy uważać, aby nie uszkodzić rdzenia kręgowego, ponieważ do usunięcia pozostaje jeszcze wiele łuków kręgowych. Bardzo pomocne jest zastosowanie nożyczek kątowych i nacinanie kilku łuków kręgowych z obu stron jednocześnie.

Następnie pociągnij za wyrostki grzbietowe, aby całkowicie usunąć łuki kręgosłupa i zbliżenie. Widać, że nożyczki muszą zostać ostrożnie wprowadzone najbardziej bocznie, po bokach kanału kręgowego. Pozostałe części boczne kręgosłupa należy usunąć, aby ułatwić późniejsze całkowite wyjęcie rdzenia kręgowego.

Anatomicznymi punktami orientacyjnymi rdzenia kręgowego są tzw. poszerzenia szyjne i lędźwiowe. Po zakończeniu ektomii całego rdzenia kręgowego należy upewnić się, że przecięto wszystkie korzenie brzuszne rdzenia kręgowego i uwolniono go z twardej opony opon mózgowych. Następnie przecina się szyjny odcinek rdzenia kręgowego.

Następnie powrócono do usuwania w kierunku czaszki. Rdzeń kręgowy należy dotykać bardzo ostrożnie, aby nie uszkodzić tej tkanki, ponieważ mogłoby to spowodować poważne ograniczenia podczas późniejszej analizy immunochemicznej. Usuwanie rdzenia kręgowego kontynuowano na poziomie piersiowym, a następnie przejście do części lędźwiowej.

Następnie wykonuje się kolejne cięcie, tym razem z boku ogona konia. Teraz możemy go całkowicie uwolnić. Tutaj widać rdzeń kręgowy umieszczony bezpośrednio obok jego pierwotnego położenia w kolumnie RAL.

Ostatecznie próbkę umieszcza się w roztworze Paraform Hyde do postfiksacji. Jako klasyczny przykład analizy immunohistochemicznej rdzenia kręgowego można zastosować przeciwciało rozpoznające cholinową acetylotransferazę w celu identyfikacji neuronów ruchowych w przednim rogu rdzenia kręgowego. Tutaj widoczna jest duża liczba neuronów ruchowych u zdrowego zwierzęcia typu dzikiego.

W przeciwieństwie do tego, u transgenicznego zwierzęcia z ALS w stadium końcowym obserwuje się znacznie mniejszą liczbę neuronów ruchowych w rogu przednim. Oglądając ten artykuł wideo, powinni Państwo zapoznać się z podstawowym badaniem klinicznym SODG 93, modelu mysiego stwardnienia bocznego zanikowego.

Zaprezentowano dwa testy behawioralne funkcji motorycznych: test rotora oraz test zwisania na drucie. Umożliwiają one rzetelną ocenę podstawowych funkcji motorycznych. Są one łatwe do przeprowadzenia, czułe w wykrywaniu deficytów motorycznych i efektywne czasowo.

Główną częścią tego filmu jest demonstracja techniki preparowania rdzenia kręgowego. Metoda ta może oczywiście zostać zastosowana w każdym innym modelu choroby myszy i stanowi kluczowy etap dla późniejszej analizy immunochemicznej patologii choroby w rdzeniu kręgowym. Dziękujemy za oglądanie.

Mamy nadzieję, że ten artykuł wideo okaże się pomocny w Państwa przyszłych eksperymentach.