Solubilizacja i biokoniugacja kropek kwantowych oraz analizy toksyczności bakteryjnej za pomocą krzywej wzrostu i metody przeliczania kolonii na płytkach

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie wysokoprzepustowego przesiewu efektów przeciwbakteryjnych nanocząstek z koniugacją lub bez koniugacji z antybiotykami. W tym celu badane są efekty przeciwbakteryjne kropek kwantowych tellurku kadmu skoniugowanych z polymiksem oraz B. Kropki kwantowe są najpierw rozpuszczane w kwasie mercaptoproponowym.

Następnie kropki kwantowe są koniugowane z poly mix i B, a następnie bakterie wysiane na płytkach z antybiotykami są traktowane zarówno koniugowanymi z antybiotykiem, jak i niekoniugowanymi kropkami kwantowymi. Połowa próbek jest poddawana naświetlaniu niebieskim światłem o długości fali 440 nanometrów przez 30 minut, co powoduje generowanie przez kropki kwantowe ekscytonów i reaktywnych form tlenu, aby ocenić wpływ traktowania kropkami kwantowymi na wzrost i przeżywalność bakterii. Wykonuje się pomiary gęstości optycznej oraz zlicza kolonie. Uzyskane dane wskazują, że zastosowanie kropkami kwantowymi z tellurku kadmu koniugowanymi z antybiotykiem, a następnie naświetlanie, daje największe efekty bakteriobójcze spośród badanych warunków.

Choć ta metoda pozwala uzyskać wgląd w wpływ kropek kwantowych tellurku kadmu i ich koniugacji z polyx in B na wzrost E coli, można ją również zastosować do innych rodzajów nanocząsteczek i antybiotyków w odniesieniu do różnych szczepów bakterii. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ jakikolwiek nadmiar MPA spowoduje agregację kropek kwantowych, a jeśli zostanie wypipetowana nawet niewielka ilość toline, doprowadzi to do zniszczenia filtra.

Choć dzisiaj zaprezentujemy metodę oceny działania przeciwbakteryjnego kropek kwantowych KE IDE sprzężonych z antybiotykiem, podobna metoda może zostać zastosowana w przypadku innych rodzajów kropkek kwantowych, takich jak fosforan indu, siarczan cynku oraz jodek kadmu z siarczanem cynku. Procedurę należy rozpocząć od przygotowania w szklanej fiolce 15 µM roztworu kropkek kwantowych tellurku kadmu (CDTE) w toluenie; za pomocą spektroskopii absorbancyjnej należy zmierzyć gęstość optyczną (OD), a następnie za pomocą pipety przenieść 200 µL tego roztworu zapasowego do szklanej fiolki.

Nie używać plastiku. Następnie dodać 800 µL toluenu, 1 mL 200 mM buforu boratowego oraz 2 µL 11,5 M kwasu 2-merkaptopropionowego (MPA), zamknąć fiolkę i energicznie wstrząsać przez 30 do 60 sekund. Po wstrząsaniu faza wodna i organiczna oddzielą się samoistnie.

Faza wodna przyjmie kolor kropek kwantowych. Aby uniknąć warstwy przejściowej, należy ją usunąć, a następnie oddzielić fazę z kropkami kwantowymi i przenieść ją do czystej probówki. W celu oczyszczenia rozpuszczonych kropek kwantowych należy przenieść je do filtra wirówkowego o pojemności 500 µL.

Dodaj 100 µL buforu bore eight o stężeniu 50 mM i wiruj z prędkością 3000 ×g przez 13 minut. Powtórz to przemywanie czterokrotnie. Po ostatnim przemywaniu zawieś oczyszczone kropki kwantowe w 500 µL buforu bore i przechowuj w temperaturze 4 °C.

Będą one stabilne przez jeden do dwóch tygodni. W celu oszacowania stężenia kropek kwantowych należy zmierzyć widma absorbancji i emisji. Rysunek ten przedstawia kropki kwantowe CDTE pod wpływem lampy UV oraz widma emisji przed i po solubilizacji w wodzie, co wskazuje na pomijalne zmiany właściwości optycznych po wymianie ligandów.

Ta część protokołu ma zastosowanie do każdej ujemnie naładowanej nanocząsteczki solaryzowanej w wodzie, w tym do mchu, komercyjnych kropek kwantowych, cząsteczek metali i innych. W tym przykładzie antybiotyk polymyksyna B (PMB) zostanie sprzężony z kropkami kwantowymi w stosunku molarnym 30:1. PMB jest dodatnio naładowany i ulega samoroskładaniu bez konieczności sprzęgania. Odczynniki: rozpuścić PMB w wodzie.

W stężeniu 60 µM. Dla płytki 96-dołkowej z 0,3 ml bakterii na dołek w czterech powtórzeniach. 0,5 ml koniugatu o stężeniu 200 nM jest wystarczające, aby przygotować ten roztwór, dodając 100 µl kropek kwantowych o stężeniu 1 µM w 50 mM buforze borowym do probówki do mikrocentryfugi.

Następnie do probówki z koniugatem należy dodać 50 µL 10x lub 60 µM roztworu antybiotyku PMB w wodzie. Do probówki kontrolnej należy dodać 50 µL wody. Objętość należy uzupełnić do 0,5 mL za pomocą 50 mM buforu ATE. Probówki należy osłonić przed światłem folią aluminiową i umieścić na rotatorze na jedną godzinę.

Jeśli dojdzie do agregacji, powtórzyć koniugację z zastosowaniem niższych stężeń antybiotyku. Miareczkować stężenie w górę, aż cząstki przestaną agregować podczas przemywania koniugatów. Przetłoczyć roztwory przez filtr o progu odcięcia 10 000 Da, który jest odpowiedni dla większości antybiotyków, ale nie dla białek lub przeciwciał.

Na koniec należy oszacować liczbę cząsteczek antybiotyku na jedną kropkę kwantową za pomocą spektroskopii absorbancji lub fluorescencji, elektroforezy w żelu lub spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera. Rysunek ten przedstawia typowe widma absorbancji i emisji kropek kwantowych przed koniugacją z PMB oraz widmo emisji po dodaniu 160 równoważników molowych PMB.

Przedstawiono tutaj zależność między stosunkiem PMB a intensywnością emisji kropek kwantowych (oznaczoną kwadratami) oraz położeniem maksimum długości fali (oznaczonym trójkątami). Wraz ze wzrostem stężenia PMB intensywność emisji QD maleje, co prowadzi do przesunięcia maksimum długości fali emisji. Kolejna część protokołu jest wykonywana wieczorem na dwa dni przed eksperymentem koniugacji w celu wyznaczenia połowicznej maksymalnej stężenia hamującego lub IC 50 antybiotyku oraz toksyczności kwantowej.

Zaszczep 10 ml pożywki LB świeżą kolonią e coli. Następnego dnia, na jedną do dwóch godzin przed eksperymentem, napełnij każde wgłębienie przezroczystej płytki 96-dołkowej. Przy użyciu pożywki wzrostowej płytka do testu powinna zostać przygotowana zgodnie z przedstawionym tutaj schematem.

Próbki należy wysiać w trzech powtórzeniach, a stężenia antybiotyków powinny obejmować zakres wystarczająco szeroki, aby zawrzeć jedno stężenie, które w niewielkim stopniu hamuje wzrost bakterii, oraz jedno, które całkowicie je eliminuje. Należy również uwzględnić w trzech powtórzeniach wszystkie dołki zawierające kropki kwantowe w stężeniach, które będą stosowane w eksperymentach z koniugatami. Za pomocą pipety wielokanałowej należy napełnić odpowiednie dołki od 1 do 50 µL kultury bakteryjnej.

Stężenie będzie zależeć od szybkości wzrostu konkretnego szczepu i będzie wymagało odpowiedniej kalibracji. Aby monitorować wzrost, umieść płytkę w czytniku płytek i ustaw odczyt co 10 minut przez dwie godziny przy 600 nanometrach. Gdy wszystkie komórki osiągną OD od 0,1 do 0,15, wyjmij płytkę z czytnika i zatrzymaj pomiar.

Następnie do odpowiednich dołków dodaj PMB w kropkach kwantowych i w trzech powtórzeniach osłoń połowę płytki folią aluminiową. Następnie umieść płytkę pod specjalną lampą o długości fali 440 nanometrów, wykonaną z diod LED o mocy 2,4 miliwata, na 30 minut, aby naświetlić oświetloną stronę płytki. Po naświetlaniu umieść płytkę w czytniku płytek i rejestruj OD 600 co 10 minut przez okres od 5 do 12 godzin, w zależności od tempa wzrostu. Jeśli to możliwe, za pomocą oprogramowania utrzymuj temperaturę poniżej 32 stopni Celsjusza, aby zapobiec wysychaniu kultur.

Nanieś krzywe wzrostu dla wybranego punktu czasowego w funkcji logarytmu stężenia i wyznacz IC 50 antybiotyku, korzystając z wyświetlonego na ekranie równania Hilla, gdzie H jest współczynnikiem Hilla. Y max to najwyższy punkt wzrostu, a Y min to punkt zerowy, najlepiej również znajdujący się na plateau. Pod koniec okresu pomiaru przeźroczyste studzienki będą wskazywać na całkowitą śmierć komórek, a wzdłuż rosnących stężeń leku powinien pojawić się gradient gęstości komórkowej.

Bakterie powinny wykazywać krzywe wzrostu w kształcie litery S, jak pokazano tutaj. Położenie maksymalnego plateau będzie się znacznie różnić w zależności od szczepu, a także zależeć od temperatury. Można wybrać konkretny punkt czasowy jako reprezentatywny i wykreślić wartości w funkcji logarytmu stężenia antybiotyku, aby wyznaczyć IC 50 w celu oceny kropek kwantowych.

Można również wykreślić przeżywalność w zależności od logarytmu stężenia kropek kwantowych, jednak uzyskanie znaczącego efektu bakteriobójczego przy użyciu samych kropek kwantowych w zastosowanym stężeniu zdarza się rzadko. Po określeniu toksyczności samych kropek kwantowych oraz samych antybiotyków, ten sam protokół można zastosować w celu określenia toksyczności antybiotyku. Przedstawiono skoniugowane kropki kwantowe.

Poniżej przedstawiono przykładowy układ analizy. Należy pamiętać, że koniugaty są testowane w rosnących stężeniach w czterech powtórzeniach; należy uwzględnić pasek kontrolny zawierający wyłącznie bakterie, pasek zawierający wyłącznie lek oraz studzienki z próbkami zawierającymi wyłącznie kropki kwantowe. Odczyty OD 600 mogą następnie posłużyć do wygenerowania krzywych wzrostu i wartości IC₅₀, podobnie jak wcześniej.

Rysunek ten przedstawia przykład koniugatów o toksyczności porównywalnej do samego antybiotyku oraz przykład koniugatów o większej toksyczności. Aby określić liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) dla każdego wariantu, należy wybrać jedną lub więcej studniek z poddanej działaniu preparatów płytki 96-dołkowej w celu wykonania posiewów na płytkach. Wybrane próbki bakteryjne należy poddać rozcieńczeniom seryjnym w roztworze soli fizjologicznej.

Aby to zrobić, nanieś pipetą 180 µL roztworu soli fizjologicznej do odpowiednich kolumn. Przenieś 20 µL zawiesiny bakteryjnej i rozcieńcz ją 180 µL roztworu soli fizjologicznej. Zmień końcówkę pipety, wymieszaj i przenieś 20 µL rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej do 180 µL roztworu soli fizjologicznej.

Powtórz ten proces sześciokrotnie. Następnie pobierz po 10 µL z każdych z sześciu ostatnich rozcieńczeń i nanieś je na prostokątną płytkę do augera. Na prostokątnej płytce można nanieść 36 plamek.

Pozostaw płytkę do wyschnięcia na blacie przez 15 minut, a następnie inkubuj ją w temperaturze 37 °C przez 16 godzin. Po inkubacji oblicz liczbę kolonii, aby wyznaczyć liczbę jednostek tworzących kolonie na mililitr. Pomnóż liczbę kolonii przez czynnik rozcieńczenia i podziel przez objętość naniesioną na płytkę, aby określić wpływ traktowań na wzrost bakterii.

Gęstość komórek e coli zmierzono przy OD 600. Przedstawiono tutaj reprezentatywne krzywe wzrostu bakterii przy różnych stężeniach leku, od zera do całkowitej śmierci komórek. Otwarte symbole oznaczają sam PMB wraz z podanymi stężeniami.

Pełne symbole oznaczają C-D-T-E-P-M-B bez napromieniowania, a symbole półpełne oznaczają C-D-T-E-P-M-B z napromieniowaniem. Napromieniowanie nie miało wpływu na próbki zawierające wyłącznie PMB, dlatego w celu zwiększenia przejrzystości wykresy te pominięto. Przedstawiono tutaj wykresy wartości krzywej wzrostu po 200 minutach w funkcji log PMB oraz dopasowania do tego równania w celu wyznaczenia wartości IC 50 dla kontroli wpływu światła.

Krzywą sporządzono przy zastosowaniu wyłącznie antybiotyku i 30-minutowej ekspozycji na światło. Rysunek ten przedstawia przeżywalność bakterii po 200 minutach w zależności od stężenia QD przy użyciu kropek kwantowych CDTE. Przy ekspozycji na światło zaobserwowano pewną toksyczność, jednak była ona zbyt mała, aby wyznaczyć wartość IC 50.

Wskazuje to, że toksyczność samego CDTE w stężeniach zastosowanych w eksperymencie koniugacji jest pomijalna w porównaniu do wpływu różnych preparatów na wzrost komórek. Wartości krzywej wzrostu z 200. minuty zostały naniesione na wykres i dopasowane do równania przedstawionego wcześniej, jak pokazano tutaj. Koniugaty C-D-T-E-P-M-B wykazały większą toksyczność niż sam PMB. W porównaniu z nimi koniugaty złotych nanocząsteczek A-U-P-M-B nie wykazały zwiększonej toksyczności względem samego PMB w celu określenia wpływu preparatów na przeżywalność bakterii.

Liczbę jednostek tworzących kolonie określono dla E. coli osadzonych na płytce 96-dołkowej, poddanych działaniu P-M-B-Q-D-P-M-B lub samego QD, z naświetlaniem promieniami I lub bez, przez 30 minut, a następnie inkubowanych w temperaturze 37 °C przez cztery godziny. Przygotowano rozcieńczenia seryjne każdej próbki bakteryjnej w roztworze soli fizjologicznej, a następnie 10 µL roztworów od 100x do 10⁷x naniesiono na płyty agarowe. Płyty inkubowano w temperaturze 37 °C i przeliczono kolonie po 16 godzinach.

W tym przykładzie kolumny płyty od A do C przedstawiają bakterie traktowane zwiększającymi się stężeniami CDTE. Konjugaty bez naświetlania oraz kolumny od D do F to bakterie traktowane zwiększającymi się stężeniami konjugatów. Wraz z 30-minutowym naświetlaniem, wzdłuż wierszy przedstawiono rozcieńczenia.

Dane wskazują, że po napromieniowaniu koniugaty wykazują silniejsze hamowanie wzrostu bakterii w porównaniu do koniugatów nienapromieniowanych. Należy pamiętać, że odczynniki zawierające Ca są niezwykle toksyczne, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek, fartuchów laboratoryjnych i gogli ochronnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania wysokoprzepustowego przesiewu efektu przeciwbakteryjnego nanocząsteczek z koniugacją do antybiotyków lub bez niej.