Wideookulografia u myszy
19 lipca 2012
Wideookulografia jest bardzo ilościową metodą badania sprawności motorycznej oczu, a także uczenia się motorycznego. W niniejszym materiale opisujemy sposób przeprowadzania wideookulografii u myszy. Zastosowanie tej techniki u myszy zdrowych, leczzonych farmakologicznie lub modyfikowanych genetycznie stanowi potężne narzędzie badawcze do zgłębiania fizjologii leżącej u podstaw zachowań motorycznych.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie wideookulografii u myszy. Osiąga się to najpierw poprzez wyposażenie myszy w konstrukcję podstawy (pedestał) na czaszce, co umożliwia unieruchomienie głowy w specjalnym stabilizatorze głowy i ciała. Drugim krokiem jest umieszczenie myszy w układzie do wideookulografii oraz kalibracja systemu śledzenia źrenic wideo.
Następnie rejestrowane są ruchy gałek ocznych podczas aktywacji układu okulomotorycznego przy użyciu szerokiego zestawu bodźców przedsionkowych i optokinetycznych. Ostatnim krokiem jest analiza tych ruchów gałek ocznych. W efekcie wideookulografia u myszy zdrowych, leczzonych farmakologicznie lub modyfikowanych genetycznie może być wykorzystywana do badania fizjologii zachowań ruchowych.
Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat okularnego układu ruchowego, można ją również zastosować do badania chorób o pochodzeniu móżdżkowym, przedsionkowym lub okularnym, wykorzystując mutanty mysie naśladujące patologie ludzkie. Aby rozpocząć tę procedurę, należy znieczulić mysz w komorze gazowej mieszaniną izofluranu i tlenu. Następnie należy podtrzymać znieczulenie, podając gaz przez maskę.
Następnie należy zastosować podkładkę grzewczą oraz analny czujnik temperatury, aby utrzymać temperaturę ciała myszy na poziomie 37 °C. Następnie należy zaaplikować maść do oczu w celu ochrony oczu przed wyschnięciem, ogolić sierść z grzbietnej części czaszki i oczyścić obszar operacyjny. Po tym czasie należy wykonać nacięcie w linii pośrodkowej, aby odsłonić grzbietną powierzchnię czaszki, a następnie oczyścić i osuszyć tę powierzchnię.
Następnie na powierzchnię Lambda nanieś kroplę kwasu fosforowego z zestawu bgma. Po 15 sekundach usuń preparat trawiący, a następnie oczyść powierzchnię czaszki solą fizjologiczną i ponownie ją osusz. Na wierzchołek wytrawionej powierzchni czaszki nanieś kroplę opti bond prime i wysusz strumieniem powietrza.
Suszyć przez 30 sekund. Następnie nałożyć kroplę adhesywu opti bond na primer opti bond. Utwardzać światłem UV przez jedną minutę.
Następnie przykryj warstwę adhezyjną cienką warstwą kompozytu Charisma. W kompozycie zatapia się łącznik z otworem na śrubę magnesu oraz miejsca mocowania. Następnie utwardź kompozyt światłem UV.
W razie potrzeby należy ponownie nałożyć dodatkowe warstwy kompozytu i utwardzić je światłem. Pozostawić mysz do rekonwalescencji przez co najmniej trzy dni po zabiegu. Następnym krokiem jest umieszczenie myszy w stabilizatorze i przymocowanie jej głowy do stabilizatora za pomocą magnesu oraz jednej śruby; następnie zamontować stabilizator głowy i ciała myszy na platformie XY.
Korzystając z platformy XY, umieść głowę myszy nad środkiem tarczy obrotowej, tak aby mysz mogła być przemieszczana wzdłuż osi pochylenia Ya i osi przechylenia. Następnie ustaw głowę pod odpowiednim kątem pochylenia ya i przechylenia, wyrównując oko na podstawie obrazu generowanego przez system skanowania oka. Obecnie tarcza obrotowa jest podłączona do silnika sterowanego serwomechanizmem AC.
Położenie tarczy obrotowej jest monitorowane za pomocą potencjometru przymocowanego do jej osi. Tarcza obrotowa jest osłonięta cylindrycznym ekranem z losowym wzorem kropek, który jest również wyposażony w silnik sterowany serwomechanizmem prądu przemiennego (AC). Położenie cylindrycznego ekranu jest monitorowane przez potencjometr przymocowany do jego osi.
Ekran może być oświetlony lampą halogenową. Ruch tarczy obrotowej i otaczającego ją ekranu jest sterowany przez komputer podłączony do interfejsu wejścia-wyjścia. Sygnały pozycji tarczy obrotowej i otaczającego ekranu są filtrowane przez częstotliwość odcięcia 20 hertz, digitalizowane przez interfejs wejścia-wyjścia i zapisywane na tym komputerze.
Oko myszy jest oświetlane przez trzy emitery podczerwieni. Dwa z nich są przymocowane do tarczy obrotowej, a trzeci jest przytwierdzony do kamery. Ten trzeci emitter generuje referencyjne odbicie rogówkowe, które jest wykorzystywane podczas procedury kalibracji oraz podczas rejestracji ruchów oka.
Kamera CCD w podczerwieni wyposażona w obiektyw zoom jest przymocowana do obrotowego stołu i skierowana na głowę myszy znajdującej się w centrum stołu. Kamerę można odblokować i przesuwać wokół osi stołu obrotowego w zakresie dokładnie 20 stopni.
Podczas procedury kalibracji sygnał wideo jest przetwarzany przez system śledzenia wzroku, który może śledzić źrenicę oraz referencyjne odbicie rogówki w kierunku poziomym i pionowym z częstotliwością próbkowania 120 hertz. Następnie sygnały referencyjnej pozycji rogówki, pozycji źrenicy oraz wielkości źrenicy są digitalizowane przez interfejs wejścia-wyjścia i zapisywane w tym samym pliku co sygnały pozycji tabeli i otaczającego ekranu w celu skalibrowania ruchów gałki ocznej; należy dostosować pozycję głowy myszy względem kamery w taki sposób, aby obraz wideo źrenicy znajdował się w środku monitora, a reprezentacja referencyjnego odbicia rogówki znajdowała się na pionowej linii środkowej oka bezpośrednio nad źrenicą.
Następnie przesuń kamerę kilkakrotnie o 20 stopni w szczycie. Wykonaj obrót wokół osi pionowej stołu obrotowego. Wykorzystaj pozycje śledzonej źrenicy oraz punktu odniesienia rogówki zarejestrowane w skrajnych pozycjach kamery, aby obliczyć promień rotacji źrenicy.
Powtórz te kroki wielokrotnie w różnych warunkach oświetlenia, aby określić zależność między wielkością źrenicy a jej rotacją. Następnie sporządź krzywą korekcji rotacji źrenicy. Teraz oblicz pozycję kątową oka, mierząc referencyjną pozycję rogówki, pozycję źrenicy oraz wielkość źrenicy.
Wartość rotacji źrenicy można wyodrębnić z krzywej korekcji rotacji źrenicy, a kątową pozycję oka można obliczyć, korzystając z następującego wzoru. Przedstawiono tutaj eksperyment dotyczący ruchu oczu w ramach VVOR. Teraz należy przekonwertować pozycje oczu, pozycje tabel oraz pozycje otaczającego ekranu na pozycje kątowe.
Następnie wyznacz pochodną i przefiltruj pozycje kątowe stołu oraz oka za pomocą filtru dolnoprzepustowego Butterwortha. Przy częstotliwości odcięcia 20 Hz usuń artefakty z sygnału prędkości oka, stosując próg detekcji 40 stopni na sekundę. Następnie uśrednij sygnały prędkości stołu i oka dla każdego pojedynczego cyklu w próbie, a uśrednione sygnały dopasuj do odpowiedniej funkcji.
Zazwyczaj stosuje się sinusoidalną stymulację prędkości, a średnie cykle dopasowuje się do funkcji sinus lub cosinus. Film ten pokazuje, w jaki sposób ruchy gałek ocznych są generowane poprzez rotację otaczającego ekranu w celu wywołania odruchu optokinetycznego, przy czym ekran obraca się w zakresie częstotliwości od 0.2 do 1 Hz z amplitudą 1,6 stopnia. Wykazano, że system optokinetyczny myszy jest bardziej wydajny w zakresie niskich częstotliwości niż w zakresie wysokich częstotliwości.
Oto kolejny film pokazujący, w jaki sposób generowane są ruchy gałek ocznych. Poprzez rotację myszy w ciemności w celu wywołania odruchu przedsionkowo-ocznego, obracano stół obrotowy w zakresie częstotliwości od 0.2 do 1 Hz z amplitudą 1.6 stopni. Wykazano, że układ przedsionkowo-oczny myszy jest bardziej wydajny w zakresie wysokich częstotliwości niż w zakresie niskich częstotliwości.
Poniższy film przedstawia sposób generowania ruchów gałek ocznych poprzez obracanie myszy w świetle w celu wywołania wizualnie wzmocnionego przedsionkowo-ocznego odruchu prostowania. Podczas obracania tarczy w zakresie częstotliwości od 0,2 do 1 Hz z amplitudą 1,6 stopnia, przy jednoczesnym dobrym oświetleniu otaczającego ekranu, wykazano, że mysz generuje efektywne kompensacyjne ruchy gałek ocznych w całym zakresie częstotliwości. Ten film pokazuje natomiast, w jaki sposób osiągnięto uczenie motoryczne poprzez adaptacyjne zwiększenie odruchu przedsionkowo-ocznego. Z zastosowaniem paradygmatu treningu w przeciwfazie, obracanie tarczy w przeciwfazie do otaczającego ekranu zwiększa wzmocnienie VOR u tej myszy.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić badanie okularystyczne wideo u myszy.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje procedurę przeprowadzania wideookulografii u myszy, będącej ilościową metodą badania sprawności ruchów gałek ocznych oraz uczenia się motorycznego. Technikę tę można zastosować u myszy prawidłowych, poddanych działaniu farmaceutyków lub zmodyfikowanych genetycznie w celu zbadania fizjologii zachowań motorycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Wydajność ruchowa oka
- Uczenie się motoryczne
Wstęp
- Wideookulografia jest metodą stosowaną do badania ruchów gałek ocznych.
- Technika ta pozwala na uzyskanie informacji na temat układu okulomotorycznego.
- Może być ona również wykorzystywana do badania chorób o podłożu móżdżkowym lub przedsionkowym.
- Modele mysie mogą na potrzeby badawcze naśladować patologie występujące u ludzi.
Cel badania
- Pomiar i analiza ruchów gałek ocznych u myszy.
- Badanie podstaw fizjologicznych zachowań motorycznych.
- Zastosowanie metody w różnych modelach mysich do badań nad chorobami.
Zastosowane metody
- Wyposaż mysz w piedestał do unieruchomienia głowy.
- Zkalibruj wideo-system śledzenia źrenic.
- Zarejestruj ruchy gałek ocznych przy użyciu bodźców przedsionkowych i optycznych.
- Przeanalizuj zarejestrowane ruchy gałek ocznych w celu uzyskania informacji fizjologicznych.
Główne wyniki
- Pomyślna kalibracja systemu śledzenia wzroku.
- Rejestracja ruchów gałek ocznych w różnych warunkach stymulacji.
- Analiza danych ujawniająca mechanizmy fizjologii zachowań ruchowych.
- Zastosowanie metody do badania chorób układu okularno-ruchowego.
Wnioski
- Wideookulografia jest potężnym narzędziem do badania ruchów gałek ocznych.
- Metoda ta może pogłębić zrozumienie uczenia się motorycznego i sprawności ruchowej.
- Posiada ona potencjał w badaniu chorób wpływających na układ okulomotoryczny.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wideookulografia u myszy zapewnia ilościowy odczyt behawioralny do oceny funkcji okulomotorycznych, umożliwiając mechanistyczną weryfikację celów terapeutycznych zaangażowanych w drogi przedsionkowe, móżdżkowe i okulomotoryczne. Metoda ta wspiera walidację celów poprzez powiązanie manipulacji genetycznych lub farmakologicznych z mierzalnymi zmianami w odruchowych ruchach gałek ocznych, co zapewnia pewność prognostyczną we wczesnej fazie badań nad nowymi lekami. Jej zastosowalność w modelach relewantnych dla chorób zwiększa ciągłość translacyjną w opracowywaniu terapii zaburzeń neuropsychiatrycznych i neurodegeneracyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych skierowanych przeciwko układom przedsionkowym, móżdżkowym i okularomotorycznym poprzez mierzalne fenotypy behawioralne.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny, kompatybilny z wysoką przepustowością test do przesiewowego badania modyfikatorów genetycznych i farmakologicznych zachowań motorycznych.
- Wartość naukowa: Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez izolację funkcji obwodów okularomotorycznych od zakłócających zmiennych motorycznych lub motywacyjnych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe pomiary zmiennych zależnych (prędkość oka, wzmocnienie, faza), co umożliwia analizę zależności dawka-odpowiedź oraz korelację genotyp-fenotyp.
- Wartość operacyjna: Ustandaryzowane protokoły kalibracji i śledzenia zapewniają odtwarzalność między laboratoriami oraz gotowość testu do oceny związków.
- Wartość naukowa: Wyniki wspierają ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnienie wkładu błądka, odruchu optokinetycznego oraz wzmocnionego wizualnie VOR w kontrolę motoryczną.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: System istotny dla przebiegu choroby: modele mysie naśladujące ludzkie patologie przedsionkowe, móżdżkowe lub oczne umożliwiają bezpośrednie dopasowanie biomarkerów translacyjnych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne śledzenie uczenia się motorycznego i plastyczności adaptacyjnej, wspierając przedkliniczną walidację terapii poznawczych i motorycznych.
- Wartość naukowa: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektów z uwzględnieniem ryzyka poprzez kwantyfikację powrotu do sprawności funkcjonalnej lub progresji deficytów w modelach genetycznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta zostaje włączona do wczesnych etapów procesów odkrywania leków jako narzędzie przesiewania fenotypowego do walidacji celu, a uzyskane wyniki dostarczają informacji niezbędnych do identyfikacji związków wiodących oraz podejmowania decyzji dotyczących postępów w badaniach przedklinicznych w oparciu o integralność układu okulomotorycznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez izolowanie wkładu przedsionkowego i optokinetycznego w kontrolę ruchów gałek ocznych.
- Przesiew: Zapewnia gotowość do przeprowadzania testów dzięki standaryzowanej fiksacji głowy, kalibracji i dostarczaniu bodźców, co umożliwia wiarygodną ocenę związków lub genotypów.
- Analityka: Dostarcza ilościowych odczytów (kątowa pozycja oka, prędkość, wzmocnienie), które są filtrowane i dopasowywane do bodźców sinusoidalnych w celu przeprowadzenia analizy porównawczej w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną dzięki możliwości zastosowania w modelach chorób, co pozwala na ocenę wpływu terapeutycznego na fenotypy zachowań motorycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku dla interdyscyplinarnych zespołów badających uczenie motoryczne, zaburzenia równowagi oraz wskazania neuropsychiatryczne.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w zakresie zaangażowania celu dzięki mierzalnym zmianom wzmocnienia i fazy VOR, OKR oraz VVOR.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane przygotowanie chirurgiczne, unieruchomienie głowy oraz śledzenie w podczerwieni zapewniają powtarzalność między laboratoriami i punktami czasowymi.
- Wartość strategiczna: Redukcja ryzyka biologicznego na późnych etapach dzięki wczesnemu wykrywaniu dysfunkcji obwodów ruchowych w modelach genetycznych lub farmakologicznych.
- Wpływ na portfolio: Wsparcie decyzji go/no-go poprzez kwantyfikację sprawności okulomotorycznej jako biomarkera integralności obwodów neuronalnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w chirurgii myszy, implantacji płytek głowowych oraz obsłudze systemów podczerwonego śledzenia ruchów gałek ocznych.
- Zależne od specjalistycznego sprzętu, w tym platform XY, obrotowych stołów sterowanych serwomechanizmem, emiterów podczerwieni oraz szybkich kamer CCD.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów chirurgicznych, procedur kalibracji i parametrów bodźców w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Kwestie adaptacyjne obejmują dostosowania specyficzne dla modelu w zależności od szczepu myszy, masy ciała oraz pigmentacji oka, co wpływa na dokładność śledzenia podczerwienią.
- Ograniczenia praktyczne obejmują czas rekonwalescencji pooperacyjnej oraz potencjalne czynniki zakłócające w postaci działania znieczulenia lub stanu zapalnego, które mogą wpływać na bazową funkcję okulomotoryczną.
