Kontrola rozmiaru, kształtu i stabilności polimerów supramolekularnych w wodzie

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest kontrola rozmiaru, kształtu i stabilności supermolekularnych nanocząstek dynamicznych w wodzie. Osiąga się to poprzez projektowanie samoorganizujących się lub polimeryzujących amplifikatorów dichotycznych, których struktura molekularna jest dostosowana do obu rodzajów oddziaływań: przyciągających i odpychających. Prowadzi to do powstania mechanizmu wzrostu z frustracją, w wyniku czego otrzymuje się samoorganizujące się nanocząstki w wodzie o kontrolowanym kształcie sferycznym.

W drugim kroku zwiększa się stężenie soli w roztworze wodnym, co osłabia oddziaływania odpychające zakodowane w strukturze cząsteczkowej amfifila dyskowej formy. Indukuje to przejście z formy sferycznej w pręcikową. W celu ujawnienia mechanizmów leżących u podstaw tego przejścia przeprowadzono badania spektroskopowe za pomocą dichroizmu kołowego (CD), zależne od temperatury. Ponadto zastosowano kombinację technik analitycznych, takich jak kriomikroskopia elektronowa w trybie przenikania oraz rezonans magnetyczny jądra, aby zmierzyć i zwizualizować przejście z jednego typu agregatu w drugi. Uzyskane wyniki wykazują, że przejście ze sfery w pręcik przejawia się poprzez zwiększoną kooperatywność w polimeryzacji supramolekularnej.

Zjawisko to wynika z przejścia z procesu antykooperacyjnego w nanop cząstkach o ograniczonej wielkości do w pełni kooperacyjnego mechanizmu elongacji nukleacji, który w tym przypadku prowadzi do powstania bardzo dużych polimerów supramolekularnych – dynamicznych nanoprętów. Główną zaletą łączenia technik spektroskopowych, takich jak spektroskopia CD, małokątne rozpraszanie promieni rentgenowskich oraz dMR, z technikami mikroskopowymi, takimi jak cryo-EM, jest możliwość pomiaru i wizualizacji przejść polimerów supramolekularnych w wodzie. Te dynamiczne polimery mogą reagować na bodźce zewnętrzne, takie jak zmiany temperatury, zmiany siły jonowej lub zmiany pH.

Połączenie tych metod ma szerokie zastosowanie i może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie chemii molekularnej oraz samoorganizujących się nanomateriałów. Na przykład można zbadać korelację między wymiarami agregatów powstałych w wyniku samoorganizacji małocząsteczkowych bloków budulcowych a podstawowymi mechanizmami ich powstawania. Implikacje tej metodologii obejmują szeroki zakres zastosowań w nanobioteknologii.

Szczególnie interesował nas obszar obrazowania biomedycznego oraz opracowywanie samoorganizujących się nanocząsteczkowych środków kontrastowych, w przypadku których dla sukcesu w zastosowaniach klinicznych kluczowy jest delikatny balans między stabilnością agregatów, wysokim kontrastem a zdolnością do wydalania tych samoorganizujących się środków kontrastowych. Pomysł połączenia technik charakterystyki pojawił się u nas, gdy zdało nam się w widoczne, że subtelne zmiany w strukturze molekularnej samoorganizujących się bloków budulcowych mogą prowadzić do fundamentalnych różnic w mechanizmie polimeryzacji nadcząsteczkowej. Procedurę zademonstruje Paul Beaumont, ekspert i osoba odpowiedzialna za zaplecze cryo 10 na Uniwersytecie Technicznym w Trovan.

Rozpocznij ten protokół od przygotowania roztworu BTA gadolinowego DTPA w 100 milimolarnym buforze cytrynianowym, zgodnie z opisem w protokole pisemnym towarzyszącym temu filmowi. Napełnij roztworem kuwetę UV Q o szerokości jednego centymetra. Włóż kuwetę do uchwytu na kuwety w kolistym spektrometrze D crowism.

Zmierzyć widmo CD w zakresie od 230 do 350 nanometrów. Następnie zmierzyć krzywą chłodzenia CD dla pasma o najwyższej intensywności w zakresie od 363 do 283 kelwinów z szybkością jednego kelwina na minutę. Następnie dodać taką samą objętość dwumolarnego roztworu buforowanego chlorku sodu do roztworu BTA gadolinium DTPA w buforze cytrynianowym.

Zwiększy to siłę jonową do 1 M chlorku sodu i rozcieńczy dyski do połowy stężenia. Po zwiększeniu siły jonowej wymieszaj roztwór w wstrząsarku typu vortex przez 40 sekund, a następnie ponownie zmierz widmo CD w zakresie od 230 do 350 nanometrów. Następnie zmierz krzywą chłodzenia CD przy najwyższej intensywności pasma CD w temperaturach od 363 do 283 kelwinów, z szybkością jednego kelwina na minutę.

Wyeksportuj surowe dane CD do programu Origin 8.5. Znormalizuj widma, przyjmując efekt CD w najwyższej zmierzonej temperaturze za zero, a efekt CD w najniższej zmierzonej temperaturze za jeden; ponieważ wielkość efektu CD jest proporcjonalna do stopnia agregacji, znormalizowane krzywe CD są proporcjonalne do stopnia agregacji. Znormalizowane dane dopasowano za pomocą opcji nieliniowego dopasowania krzywej w programie Origin Pro 8.5, wykorzystując model samoorganizacji zależny od temperatury.

W tym modelu wyróżnia się reżim nukleacji oraz reżim elongacji. Najpierw dopasuj stopień agregacji w reżimie elongacji. W tym równaniu T reprezentuje zmienną temperaturę.

PHI N to wypadkowa helikalność, która jest proporcjonalna do stopnia agregacji, a HE to molekularna entalpia wydłużania. T TE oznacza temperaturę wydłużania, czyli temperaturę, przy której samorzutna organizacja zaczyna stawać się termodynamicznie korzystna. Wprowadzono czynnik normalizacji fiat, aby zapewnić, że stosunek Phi N do fiat nie przekroczy jedności, co wynika z ograniczenia, zgodnie z którym stopień agregacji nie może zostać przekroczony.

Dopasowanie jedności (unity fitting) pozwala na wyznaczenie entalpii wydłużania w dżulach na mol oraz temperatury wydłużania w Kelvinach, która charakteryzuje samoorganizację cząsteczek dla danej koncentracji. Podczas dopasowania należy przestrzegać ograniczenia, zgodnie z którym dopasowywany powinien być tylko stopień agregacji w temperaturach poniżej TE, ponieważ równanie jest ważne wyłącznie w reżimie wydłużania; po dopasowaniu pierwszego równania jedynym nieznanym parametrem w równaniu dla reżimu nukleacji jest stała aktywacji ka, która opisuje kooperatywność polimeryzacji supramolekularnej. Aby wyznaczyć stałą aktywacji, należy dopasować eksperymentalnie otrzymany stopień agregacji dla temperatur powyżej TE w reżimie nukleacji.

Zacznij od przygotowania roztworów do mikroskopii elektronowej zgodnie z opisem w tekście. Krótko mówiąc, przygotuj dwa bufory: bufor cytrynianowy 100 mM oraz bufor cytrynianowy 100 mM z rozpuszczonym 5 M chlorkiem sodu. Rozpuść BTA gadolinium DTPA w 0,1 ml każdego z przygotowanych buforów, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM. Następnie poddaj obróbce plazmowej siatkę Quantifoil powlekaną węglem, używając C Resington 2 0 8 carbon coer przy natężeniu 5 mA przez 40 sekund.

Procedura witryfikacji jest kluczowym etapem krio-przygotowania, ponieważ zapewnia, że cienka warstwa błyszczącego ISIS wytworzona podczas procesu jest odpowiednia do analizy TAM. Roztwór wodny jest naniesiony na siatkę podczas witryfikacji w automatycznym urządzeniu FEI vitro bot. Proces ten obejmuje naniesienie próbki na siatkę, odsączenie nadmiaru cieczy w celu utworzenia cienkiej warstwy roztworu wodnego na siatce oraz następującą po tym witryfikację poprzez bardzo szybkie zanurzenie siatki w ciekłym etanie.

Po witryfikacji przenieś potraktowaną siatkę do ciekłego azotu w celu jej utrwalenia, a następnie ręcznie przenieś siatkę z próbką do kasety autoloadera, która również jest chłodzona ciekłym azotem. Kolejnym krokiem jest umieszczenie kasety w automatycznym ładowarzu TEM TUE cryo Titan. TUE Cryo Titan jest wyposażony w działo emisyjne pracujące przy napięciu 300 kV.

Rejestrowanie obrazów TAM wymaga doświadczenia i sprawnego operowania sprzętem. Wynika to z faktu, że wysokoenergetyczna wiązka elektronów uszkadza preparat podczas obrazowania. Obrazy należy rejestrować za pomocą kamery CCD wyposażonej w filtr energetyczny z bramką za kolumną. Ponieważ gadolin jest silnie paramagnetyczny i sygnały protonowe uległyby w związku z tym znacznemu poszerzeniu, zastosowano inny dysk, w którym gadolin zastąpiono diamagnetycznym itrem oraz roztworem BT atrium.

Przygotowano DTPA. Oblicz, ile miligramów BT atrium DTPA o masie cząsteczkowej 2 979 g/mol jest wymagane do uzyskania docelowego stężenia 1 mM. Następnie rozpuść wyznaczoną ilość BT atrium DTPA w 50 mM buforze bursztynianowym w D₂O, po czym pipetuj 0,6 ml otrzymanego roztworu do probówki NMR firmy Wilm, LABAs.

Wprowadzić próbkę do modułu variant w spektrometrze Nova 500 wyposażonym w sondę I-D-P-F-G o średnicy pięciu milimetrów firmy Varian. Przeprowadzić eksperymenty DOI zgodnie z opisem w tekście, po zarejestrowaniu standardowego widma NMR protonowego z zastosowaniem impulsu 90 stopni i odpowiednią optymalizacją czasów mieszania. Jednostkową sekwencję impulsów DOI stosuje się po wyznaczeniu samodyfuzji HDO w referencyjnej sondzie jajnikowej, a w próbce wyznacza się współczynnik dyfuzji agregatów, na podstawie którego można obliczyć promień hydrodynamiczny.

Na koniec oblicz promienie hydrodynamiczne RH agregatów, wykorzystując równanie Stokesa-Einsteina dla dyfuzji cząstki sferycznej. Charakter jonowy peryferyjnych kompleksów gadolinu z DTPA wprowadza frustrację w jednowymiarowym wzroście monomerów dyskowych, których rdzeń został zaprojektowany tak, aby polimeryzować w wydłużone, pręcikowe agregaty. Równowaga między oddziaływaniami przyciągającymi a odpychającymi kontroluje rozmiar i kształt agregatów.

Potężną techniką służącą do wyznaczania rozmiaru i kształtu cząsteczek oraz roztworów jest wykorzystanie źródła synchrotronowego. Rozproszone promienie rentgenowskie pod małym kątem lub SAXS. Gadolin DTPA rozpuszczono w roztworze buforu cytrynianowego, a następnie zarejestrowano profile SAXS dla dwóch różnych stężeń.

Nachylenie dążące do zera w obszarze niskich wartości Q wskazuje na brak określonego kształtu i izotropię agregatu, co sugeruje obecność obiektów sferycznych. Dane pomiarowe przy różnych stężeniach dopasowano do homogenicznego, monodyspersyjnego czynnika kształtu sfery, co pozwoliło obliczyć promień wynoszący 3,2 nanometra. Obliczony promień geometryczny monomeru disco-BTA gadolinowej DTPA wynosi 3,0 nanometra, co potwierdza obecność agregatów o stosunku boków bliskim jedności, dostarczając dalszych dowodów na sferyczny kształt i nanometryczny rozmiar obiektów powstałych w wyniku samozgrupowania.

Przeprowadzono spektroskopię NMR z dyfuzyjnym uporządkowaniem protonów. DOI NMR pozwala na wyznaczenie współczynników dyfuzji agregatów nadcząsteczkowych, z których można obliczyć ich promień hydrodynamiczny. Współczynnik dyfuzji zagregowanego diamagnetycznego wzmacniacza dichotycznego w zbuforowanym deuterowanym bursztyianie wyniósł 0,69 × 10⁻¹⁰ m²/s, wyznaczone zgodnie z relacją Stokesa-Einsteina.

Dla obiektów o rozmiarze sferycznym obliczono promień hydrodynamiczny wynoszący 2,9 nanometrów. Wartość ta wykazuje doskonałą zgodność z wynikiem uzyskanym z danych SOX dla BTA gadolinium DTPA. Dalsze dowody na skuteczną kontrolę długości jednowymiarowego stosu uzyskano z mikrografii cryo TEM.

BTA gadolinowy DTPA tworzy oczekiwane obiekty sferyczne o średnicach bliskich 6 nm przy stężeniu 1 mM, co potwierdza wyniki pomiarów so oraz DOI. Formowanie się supramolekularnych polimerów w postaci prętów o wysokim współczynniku proporcji jest wyraźnie widoczne na mikrografiach cryo te przy wysokiej sile jonowej. Najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem tego zjawiska jest ekranowanie elektrostatyczne.

Kształt zmienia się z sferycznego agregatu o średnicy około sześciu nanometrów w wydłużone pręty o średnicy sześciu nanometrów i długości do kilkuset nanometrów. Przedstawiono tutaj widma CD BTA Gadolinium DTPA w temperaturze pokojowej przy zwiększającym się stężeniu soli. Stężenie BTA gadolinium DTPA wynosi 8 × 10⁻³ mM przy niskiej sile jonowej oraz 4 × 10⁻³ mM przy wysokiej sile jonowej.

Chociaż do pomiarów CD zastosowano znacznie niżższe stężenie, wyraźny efekt bawełniany wskazuje na obecność nienaruszonych agregatów nawet przy stężeniach mikromolarnych. Kształt widma CD zmienia się wraz ze wzrostem stężenia soli, co stanowi dobrą przesłankę za zredukowanymi oddziaływaniami odpychającymi na obwodzie stosów oraz gęstszym upakowaniem decosów. Ponadto krzywe chłodzenia CD dla tych samych roztworów wykazują wyraźne różnice w kształcie.

Temperatura, przy której rozpoczyna się agregacja, przesuwa się w stronę wyższych wartości wraz ze wzrostem stężenia soli. Staje się również widoczny coraz bardziej kooperatywny mechanizm, charakteryzujący się gwałtowniejszym wzrostem efektu CD, podczas gdy krzywa chłodzenia przy stężeniu 0 M NaCl jest najlepiej opisywana przez izometryczny model samoorganizacji, co wskazuje na proces antykooperatywny. Krzywa chłodzenia przy stężeniu 1,0 M NaCl jest typowa dla kooperatywnego procesu samoorganizacji i może być opisana modelem nukleacji i elongacji, pozwalającym na określenie parametrów termodynamicznych samoorganizacji kompleksu BTA z gadolinem DTPA przy stężeniu 0 i 1 M NaCl.

Zastosowanie modelu kooperatywnego wyraźnie wykazuje spadek ka, która jest bezwymiarową stałą aktywacji. Niższe wartości KA wskazują na wyższy stopień kooperatywności w procesie samoorganizacji, co objawia się tworzeniem silnie wydłużonych polimerów supramolekularnych. Jak zaobserwowano w cryo TEM, podczas stosowania zademonstrowanych technik eksperymentalnych należy pamiętać, że tylko kombinacja metod badawczych pozwoli na uzyskanie sensownego, całościowego opisu badanych dynamicznych nanomateriałów.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat szerokiego zakresu zastosowań naszego połączonego podejścia eksperymentalnego oraz tego, w jaki sposób może ono pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nanomateriałów samoorganizujących się i superpoematów.