Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

Ogólnym celem niniejszej procedury jest generowanie i charakterystyka limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (komórek IPS). Komórki IPS mogą być następnie różnicowane in vitro w systemie hodowlanym OP9 DL1, a następnie dojrzewać in vivo w myszy z niedoborem rag. Alternatywnie komórki mogą zostać zmodyfikowane genetycznie w celu nadekspresji TCR OT-I, a następnie przeniesione adoptywnie w celu rozwoju in vivo.

Po sześciu tygodniach różnicowania in vivo myszy można poddać próbie poprzez dosytatyczne wstrzyknięcie komórek nowotworowych EEG seven, a następnie ocenić specyficzność antygenową limfocytów T pochodzących z iPS. Ostatecznie komórki iPS mogą różnicować się zarówno w konwencjonalne, jak i specyficzne antygenowo limfocyty T, z których te drugie są zdolne chronić zwierzęta przed wyzwaniem nowotworowym. Zastosowania tej techniki rozszerzają się w kierunku indywidualizowanej immunoterapii nowotworów.

Metoda ta pozwala na generowanie dużej liczby reaktywnych przeciwko nowotworowi limfocytów T pochodzących z minimalnej ilości krwi pacjenta lub tkanki skóry. W dniu zerowym przenieść 5×10⁴ komórek iPS na 100-milimetrową płytkę hodowlaną zawierającą konfluentną monowarstwę komórek OP9-DL1 w pośrodku alpha-MEM z 20% FBS. W dniu piątym przeprowadzić trypsynizację. Następnie odwirować komórki po inkubacji na świeżej 100-milimetrowej płytce hodowlanej przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37°C. Wysiać 5×10⁵ zawiesinowych komórek w pośrodku alpha-MEM z 20% FBS i ligandem mouse flt3 na nową 100-milimetrową płytkę zawierającą monowarstwę komórek OP9-DL1. W dniu ósmym delikatnie pobrać pipetą słabo przytwierdzone komórki, odwirować je, a następnie przenieść do pojedynczego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej konfluentnymi komórkami OP9-DL1. Inkubować komórki w temperaturze 37°C i 5% CO₂ przez kolejne dwa tygodnie. W dniu 22.

Inkubować odseparowane komórki IPS w świeżej pożywce na nowej płytce hodowlanej w temperaturze 37°C przez 30 minut. Następnie usunąć około połowy zawiesiny komórek i przepuścić ją przez nylonowe sito o oczkach 70 µm w celu wyeliminowania agregatów komórkowych, a otrzymaną zawiesinę pojedynczych komórek przemyć trzykrotnie zimnym PBS. Po trzecim przemyciu resuspender komórki w PBS do stężenia 1,5 × 10⁷ komórek/ml i przechowywać je w lodzie przed wstrzyknięciem dożylnym (IV).

Umieść czterotygodniową mysz z niedoborem rag pod lampą podczerwienią, aby rozszerzyć żyłę ogonową. Następnie napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 26,5 G 200 µL zawiesiny komórkowej i przeprowadź transfer adopcyjny komórek poprzez rozszerzoną żyłę ogonową. Trzy tygodnie później, po potwierdzeniu eutanazji myszy poddanej transferowi adopcyjnemu, usuń węzły chłonne oraz śledzionę po mechanicznym rozdrobnieniu tkanek.

Zliozyj zawiesinę pojedynczych komórek za pomocą buforu do lizy CK, a następnie dwukrotnie przemyj otrzymane monocyty zimnym PBS. Następnie, po barwieniu markerów powierzchniowych komórek, oceń komórki za pomocą analizy cytometrycznej w dniu zerowym; w dniu pierwszym użyj odczynnika do transfekcji genów JAMA, aby przeprowadzić nocną transfekcję wysianych komórek opakowujących plat E za pomocą OT one MIDR; w dniu drugim wysiej 1×10⁶ komórek iPS do jednej studni 24-dołkowej płytki uprzednio pokrytej 0,1% żelatyną; pobierz pseudowirusy zawierające S natin z komórek plat E, a następnie przepuść je przez filtr 0,4 µm w celu usunięcia potencjalnych zanieczyszczeń po wirowaniu. Przeprowadź transdukcję komórek w obecności polybrenu przez jedną godzinę przy 330×g w temperaturze 32°C.

Inkubować je przez noc w tej samej temperaturze po powtórzeniu procedury transdukcji. W czwartym dniu potraktować transdukowane komórki iPS trypsyną, a następnie po odwirowaniu zawiesić komórki w świeżej pożywce i wysiać je na uprzednio przygotowane napromieniowane komórki karmidła snl 7 6 7. Po osiągnięciu przez transdukowane komórki pełnej konfluencji, wyizolować komórki podwójnie dodatnie dla GFP i DS red za pomocą cytometrii przepływowej.

Sześć tygodni po adopcyjnym transferze komórek IPS, w 50. dniu wyzwania nowotworowego, wstrzyknąć 50 µL komórek EEG seven thoma do jamy otrzewnowej tej samej myszy. Użyć zestawu Miltenyi Biotec do izolacji limfocytów T CD8+, aby wyizolować limfocyty T CD8+ ze śledziony i węzłów chłonnych zwierzęcia poddanego transferowi adopcyjnemu. Wymieszać wyizolowane limfocyty T CD8+ z napromieniowanymi komórkami SPOC z naiwnej myszy C57BL/6J w stosunku 1:10 i inkubować kokulturę z 0,5 µmol/ml OVA przez 40 godzin.

Następnie dodaj felden A do komórek na kolejne cztery godziny. Na koniec oceń populacje komórek za pomocą analizy cytometrycznej. Po wyizolowaniu komórek SP z naiwnej myszy C 57 black six J, podziel zawiesinę komórkową na dwie grupy.

Oznacz grupę CFSE high za pomocą 5 µM CFSE i inkubuj komórki z 10 µg/ml peptydu OVA przez jedną godzinę, natomiast grupę CFSE low oznacz 0,5 µM CFSE i nie inkubuj z peptydem. W PBS zmieszaj 2,5 × 10⁶ komórek CFSE high z 2,5 × 10⁶ komórek CFSE low. Następnie przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem ekspresji CFSE.

16 godzin po transferze adopcyjnym do wybranej myszy. Aby policzyć komórki nowotworowe w jamie otrzewnej w 20. dniu wywołania nowotworu, należy użyć strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 18,5 G oraz zimnego PBS do płukania jamy otrzewnej. Policz odzyskane komórki nowotworowe w celu zidentyfikowania komórek naciekających guz.

Usunąć guz w późnej fazie wywołania nowotworu, a następnie podzielić go na trzy części. Pierwszą część guza umieścić w probówce kriogenicznej i postawić probówkę na suchym lodzie. Drugą część niezwłocznie utrwalić w formaldehydzie.

Przechowuj trzeci fragment w kondycjonowanym medium RPMI 1640 po wysuszeniu na powietrzu kriokonserwowanych sekcji tkanek. Utrwal je w zimnym acetonie przez 15 minut, po wcześniejszym wysuszeniu na powietrzu utrwalonych sekcji przez kolejne 15 minut. Po tym etapie przemyj preparaty na szkiełkach przez pięć minut w PBS.

Umieść preparaty w komorze wilgotnej i pokryj skrawki tkanek 30 µL 3%B, SA i PBS na 30 minut, aby zablokować niespecyficzne wiązanie. Następnie usuń nadmiar buforu blokującego za pomocą papierowego ręcznika i inkubuj skrawki tkanek w komorze wilgotnej przez dwie godziny z 50 µL mieszaniną przeciwciała pe anti TCR RV alpha two oraz przeciwciała fitzy anti ova rozcieńczonych w 3%PSA w PBS. Po zakończeniu inkubacji przemyj preparaty trzy razy w zimnym PBS, a na koniec zamknij skrawki w wodnym medium montażowym przed badaniem w mikroskopie fluorescencyjnym w celu analizy cytometrycznej limfocytów T naciekających guz.

Rozgnieć guza, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Następnie przeanalizuj komórki pod kątem specyficznych markerów powierzchniowych. CD3 oraz TCR beta są wykorzystywane jako markery limfocytów T, aby ustalić, czy stymulacja komórek iPS ligandem Notch DL1 mogłaby przyczynić się do różnicowania w kierunku limfocytów T. Oceniono ekspresję powierzchniową CD4 i CD8 na komórkach pochodzących z iPS, które były dodatnie pod kątem CD3 i TCR beta.

Należy zwrócić uwagę na wykres kropkowy po prawej stronie, który przedstawia dzień 22 dla pojedynczo pozytywnych limfocytów T (CD3+, TCRβ+, CD4-, CD8+), wygenerowanych in vitro z komórek iPS. Ponadto, pochodzące z komórek iPS komórki pojedynczo pozytywne z poprzedniej ryciny produkowały interleukinę 2 oraz interferon gamma po stymulacji in vitro za pomocą przeciwciał anty-CD3 naniesionych na płytkę oraz rozpuszczalnych przeciwciał anty-CD28, co potwierdza, że limfocyty T pochodzące z komórek iPS są funkcjonalne po transferze adoptywnym do myszy biorcy. Większość transdukowanych genem TCR komórek iPS uległa różnicowaniu w CTL CD8+, które zareagowały in vitro na stymulację peptydową poprzez wydzielanie interleukiny 2 i interferonu gamma, co przedstawiono na tych wykresach kropkowych z połączonych komórek węzłów chłonnych i śledziony.

Komórki T CD8+ Vβ5+ zostały wygenerowane u myszy, którym adoptywnie przeniesiono iPS przekształcone TCR, a nie kontrolne iPS. Populacje CD8+ Vβ5+ wykazano jako dodatnie w barwieniu wewnątrzkomórkowym cytokin dla produkcji interleukiny 2 oraz interferonu gamma, co na tych histogramach przedstawiono za pomocą ciemnych linii w porównaniu z zacieniowanymi histogramami kontroli izotypowej, co wskazuje na funkcjonalność CTL pochodnych z iPS. Dane te przedstawiają komórki CFSE high stymulowane eptydem (piki po prawej stronie każdego wykresu) oraz kontrolne komórki CFSE low (piki po lewej stronie), które wstrzyknięto myszom 10 tygodni po transferze komórek iPS lub jeden dzień po transferze CTL OT-I.

Antygenowo swoiste limfocyty CTL pochodzące z iPS odpowiedziały na stymulację antygenem i wykazały aktywność cytotoksyczną, co wskazuje brak komórek CFSE high w tym miejscu. Komórki iPS z przetransdukowanym genem TCR OT-1 zostały przeniesione adoptywnie do myszy C57BL/6, a następnie myszy zostały poddane wyzwaniu komórkami nowotworowymi EEG7; w 20. dniu policzono komórki nowotworowe w jamie otrzewnej. Zauważono znaczną redukcję liczby komórek nowotworowych u myszy, które otrzymały iPS z przetransdukowanym TCR, w porównaniu z grupami kontrolnymi.

Co najważniejsze, adoptywny transfer komórek iPS przetransdukowanych TCR wywołał naciek nadreaktywnych komórek CTL do tkanek nowotworowych i chronił zwierzęta przed wyzwaniem nowotworowym, co widać na tym barwieniu H&E tkanek nowotworowych pobranych od 30 do 35 dni po wyzwaniu nowotworowym; guzy pochodziły z myszy, którym adoptywnie transferowano komórki przetransdukowane TCR lub komórki OT-I CTL, ale nie z myszy poddanych iniekcji pozorowanej lub kontrolnej. Komórki przetransdukowane zostały nacieknięte przez komórki zapalne, co wskazują tutaj czerwone strzałki. Stwierdzono, że swoiste dla Ova komórki CTL dodatnie pod kątem Vα2 (zaznaczone na czerwono) naciekają tkanki nowotworowe wykazujące ekspresję Ova (zaznaczone na zielono).

Podczas gdy guzy u myszy z grup kontrolnych wykazywały w tej postaci rzadsze występowanie lub całkowity brak komórek naciekających guz, zawiesiny pojedynczych komórek z tkanek nowotworowych poddano analizie ekspresji V alpha two oraz V beta five metodą cytometrii przepływowej po wyselekcjonowaniu populacji CD eight positive. Należy zauważyć, że tkanki nowotworowe od myszy, którym adoptywnie przeszczepiono komórki IPS po transdukcji TCR, wykazywały najwyższy poziom nacieku komórek do guza, natomiast guzy od myszy, które otrzymały kontrolne komórki IPS po transdukcji, nie wykazały nacieku swoistych dla ova komórek T CD eight positive.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak generować limfocyty T specyficzne dla antygenu z komórek iPS oraz jak oceniać funkcje limfocytów T pochodzących z komórek iPS.