Unieruchomienie planarii, częściowe napromieniowanie i transplantacja tkanek

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest umieszczenie populacji zdrowych komórek macierzystych sąsiadująco z tkanką pozbawioną komórek macierzystych u planarii, aby przeanalizować zachowanie komórek macierzystych i ich potomstwa in vivo podczas regeneracji. Osiąga się to poprzez znieczulenie i unieruchomienie planarii nienaświetlanej lub naświetlonej promieniami X w celu dalszej manipulacji. Następnie unieruchomioną planarię nienaświetlaną częściowo osłania się ołowiem, a następnie naświetla promieniami X, co pozwala uzyskać nieuszkodzoną planarię z tkanką pozbawioną komórek macierzystych sąsiadującą z tkanką osłoniętą, która nadal zawiera komórki macierzyste.

Alternatywnie, przeszczep tkanki pobranej od nienaświetlonego dawcy może zostać wszczepiony do wcześniej naświetlonego gospodarza, aby uzyskać organizm z izolowaną populacją komórek macierzystych. W przypadku gospodarza, w którym komórki macierzyste zostały usunięte, uzyskuje się wyniki wykazujące izolowane populacje komórek macierzystych sąsiadujące z tkankami pozbawionymi tych komórek, co potwierdzono za pomocą hybrydyzacji in situ RNA całego preparatu dla genów markerowych komórek macierzystych.

Opisane tutaj metody mają na celu lepsze zrozumienie regeneracji planariów poprzez badanie zachowania komórek macierzystych zarówno w modelu transplantacji, jak i w modelu częściowego napromieniowania, co pozwala sprawdzić, czy otaczające tkanki i lokalne środowisko, w którym znajdują się te komórki macierzyste, wpływają na zachowanie tych neoblastów lub komórek macierzystych. W procesie regeneracji, od jednego do dwóch miesięcy przed eksperymentem, należy karmić planarie zgodnie z towarzyszącym artykułem. W celu uzyskania pożądanego rozmiaru w tym pokazie, wybrano planarie o długości od 1 do 2 cm i szerokości powyżej 2 mm.

Następnie, na trzy do siedmiu dni przed użyciem, poddaje się je głodzeniu. Kolejnym krokiem jest przygotowanie roztworu Chloro tone, łagodnego miejscowego środka znieczulającego, poprzez rozpuszczenie 0,1 do 0,2% w/v cleone w wodzie parianej. Następnie roztwór należy schłodzić w lodzie. Do transplantacji tkanek, przy użyciu palnika Bunsena, należy zgiąć rurkę kapilarną o średnicy wewnętrznej 0,75 mm pod kątem 90 stopni w odległości jednego do dwóch centymetrów od końca, aby umożliwić odcięcie tkanki przeszczepowej.

Następnie zegnij drugą kapilarę o średnicy zewnętrznej 0,7 milimetra w odległości jednego do dwóch centymetrów od końca pod kątem 90 stopni, aby stworzyć otwór w organizmie gospodarza do przyjęcia przeszczepu. Następnie wytnij czarną papierową filtracyjną Whatman numer trzy, papier filtracyjny Kimwipe oraz papier do skręcania papierosów zgodnie z wymiarami wskazanymi w towarzyszącym manuskrypcie.

Następnie należy przygotować zmodyfikowany roztwór Holta Fersa oraz nasycony roztwór Holta Frettera Caine'a. Oba roztwory należy schłodzić do 4 °C. Następnie do kwadratu z Paraformu należy przyczepić złożoną chusteczkę Kim wipe.

Umieść go na płycie chłodzącej Peltiera lub innym urządzeniu chłodzącym pod stereomikroskopem. Następnie nasącz chusteczkę Kim schłodzonym roztworem Holta-Frettera. Po czym połóż dwa czarne prostokąty z papieru filtrującego na chusteczce Kim.

Teraz umieść kawałek papieru filtracyjnego Whatman nr 2 w szalce Petriego. Zwilż papier filtracyjny roztworem Holta-Frettera. Następnie schłodź szalkę na lodzie w celu przeprowadzenia częściowego napromieniowania.

Umieść większą wyściółkę papierową w większym naczyniu, analogicznie do transplantacji tkanek. Zwilż papier filtrujący roztworem Holt Fretter. Następnie schłodź naczynie na lodzie.

W tej procedurze napełnij szalkę Petriego schłodzonym roztworem cleonu. Przenieś planarię pipetą do szalki w celu transplantacji. Anestezuj tylko jednego biorcę i jednego dawcę jednocześnie.

W przypadku naświetlania częściowego można jednocześnie znieczulić wiele zwierząt. Następnie należy pozostawić parie w roztworze cleone na od 5 do 10 minut, aż przestaną się poruszać. Parie należy wypłukać, przenosząc je pipetą do naczynia z schłodzonym roztworem Holt Fretter.

Następnie unieruchom obszar plin, pipetując go na czarne papiery filtracyjne nasączone schłodzonym roztworem Holt fretter. Następnie, za pomocą pęsety, ustaw je stroną brzuszną do dołu. Teraz umieść wcześniej przygotowaną, schłodzoną szalkę Petriego w wiadrze z lodem, która zmieści się wewnątrz irradiatora rentgenowskiego z górnym źródłem.

Ułóż znieczulonego planarię w czalce Petriego, przesuwając czarne filtry papierowe. Następnie przenieś je do górnego naświetlacza promieni Rentgena, ustawiając wiadro z lodem w taki sposób, aby zminimalizować odległość od rury katody do planarii. Pozwoli to zmaksymalizować efektywną dawkę promieniowania.

Następnie umieść osłony ołowiane pomiędzy parianem a lampą katodową w celu podania dawki promieniowania rentgenowskiego. Jeśli pożądana jest całkowita ablacja komórek macierzystych w obszarach nieosłoniętych, podaj dawkę 30 grays lub wyższą. Natychmiast po emisji promieniowania rentgenowskiego przenieś parian do schłodzonej wody z parianem.

Następnie należy pozwolić, aby woda pariańska ogrzała się do temperatury pokojowej, a zwierzęta same odczepiły się od czarnego papieru filtracyjnego. Procedura częściowego napromieniowania jest teraz zakończona. Aby rozpocząć tę procedurę pod mikroskopem stereoskopowym, należy umieścić znieczulonego gospodarza i obszar donora na oddzielnych prostokątnych czarnych filtrach na chusteczce Kim wipe, która została wcześniej schłodzona na elemencie Peltiera lub płycie chłodzącej.

Za pomocą kapilary o średnicy wewnętrznej 0,75 mm należy wyciąć fragment przeszczepu z dawcy. Następnie za pomocą pęsety należy umieścić go w nieużytkowanej części gospodarza. Po tym użyć kapilary o średnicy zewnętrznej 0,7 mm, aby usunąć fragment tkanki z gospodarza.

Następnie umieść przeszczep w otworze. Przenieś przeszczepionego gospodarza z prostokątnego czarnego papieru filtracyjnego do wcześniej przygotowanej szalki Petriego. Zwilż kawałek papieru zwijalnego roztworem nasyconym Holt Fretter z dodatkiem Caine.

Następnie umieść go na powierzchni przeszczepionego gospodarza. Dalej, namocz cztery kawałki papieru filtracyjnego w nasyconym roztworze Holtera, a w przypadku podłoża gospodarza po przeszczepie, namocz cztery kawałki pociętego ręcznika papierowego Kimwipe w nasyconym roztworze Holt Fretter. Połóż je na papierach filtracyjnych.

Następnie zamknij pokrywkę. Umieść szalkę Petriego na lodzie. Następnie przenieś pariana dawcę do wody dla parianów w celu rekonwalescencji i regeneracji.

Po zakończeniu wszystkich przeszczepów umieść przeszczepiony parian w inkubatorze w temperaturze 10 °C na noc. Następnego dnia rano przenieś go do szalki Petriego wypełnionej wodą dla parianów. Pozwól parianowi samodzielnie oddzielić się od papieru filtracyjnego lub delikatnie usuń go pęsetą, a następnie wymieniaj wodę dla parianów raz na dwa do trzech dni.

Hybrydyzacja in situ całego preparatu w przypadku napromieniowanego, lecz w pełni osłoniętego kontrolnego osobnika parian utrwalonego trzy dni po napromieniowaniu wykazuje rozkład komórek macierzystych nieodróżnialny od rozkładu u typu dzikiego parian. Z kolei w przypadku osobnika parian, który był osłonięty tylko częściowo, z pozostawieniem odsłoniętych części przedniej i tylnej, komórki macierzyste wydają się być usunięte z regionów nieosłoniętych. Tutaj przedstawiono widoki grzbietowy i brzuszny pomyślnie przeszczepionego osobnika parian.

Trzy dni po transplantacji szczep jest wyraźnie widoczny zarówno na powierzchni grzbietowej, jak i brzusznej, a w miejscu styku szczepu z biorcą otacza go charakterystyczna, niepigmentowana tkanka. W przypadku nieudanej transplantacji w miejscu wszczepienia nie obserwuje się widocznej tkanki szczepu. Hybrydyzacja in situ w preparacie całego organizmu wykazała obecność komórek macierzystych wyłącznie w obrębie lub w pobliżu miejsca szczepienia, co po opanowaniu techniki wskazuje na sukces transplantacji.

Przeszczepy można przeprowadzić w czasie zaledwie pięciu minut każdy. Przy współczynnikach sukcesu sięgających 90 do 100% zakresy naświetlania częściowego można znacznie zwiększyć, zakładając, że pole naświetlania urządzenia jest wystarczająco duże.