Przygotowanie czynnika wzrostu limfocytów T ze splenocytów szczura

Witam, nazywam się Christine Beaton. Jestem pomocnikiem badawczym w laboratorium George'a Chen w Katedrze Fizjologii i Biofizyki na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine. W ciągu najbliższych dwóch dni pokażę Państwu, jak przygotować TCGF, czyli czynnik wzrostu limfocytów T.

Zatem w codziennej hodowli komórkowej, gdy nie potrzebujemy dokładnej wiedzy na temat składu cytokin w pożywce, stosujemy czynnik wzrostu limfocytów T (TCGF), który jest nadsączem z hodowli śledziony zawierającym cytokiny niezbędne do ekspansji limfocytów T. TCGF przygotowujemy w następujący sposób: po uśmierceniu zdrowych szczurów linii Lewis pobieramy ich śledziony, przygotowujemy zawiesinę pojedynczych komórek, usuwamy erytrocyty poprzez ich lizę, a następnie komórki mononuklearne stymulujemy konkanawalną A, co indukuje limfocyty T do produkcji wszystkich cytokin wymaganych do ich wzrostu. Aby uzyskać TCGF, musimy aktywować komórki.

Procedura polega na dodaniu do hodowli komórkowej lektyny Con A (skrót od konkanawaliny A). Po dodaniu Con A do hodowli komórkowej, zwiąże się ona z glikozylowanym kompleksem receptora limfocytów T. Dzięki jednoczesnemu wiązaniu się z kilkoma kompleksami dojdzie do procesu zwanego cappingiem. W rezultacie receptory na powierzchni komórki ulegną agregacji, tworząc klastry, co wywoła sygnał aktywacyjny w limfocytach T.

Po aktywacji komórki zaczną przechodzić proces blastogenezy. Powiększą się, a następnie zaczną wydzielać cytokiny. Pierwotnie sądzono, że TCGF to głównie interleukina 2, ale obecnie wiadomo, że nie jest to tak w rzeczywistości.

Zawiera ono również interferon gamma, TNF alfa, a prawdopodobnie także cytokiny w bardzo niewielkich ilościach, które są niezbędne do utrzymania żywotności komórek. Po 48 godzinach hodowli komórki wyprodukowały wszystkie potrzebne nam cytokiny. Przystąpimy zatem do usunięcia komórek, a gdy zostaniemy z samym naddatkiem, wciąż będziemy mieć w nim wolny konal. Będzie to problemem, ponieważ chcemy wykorzystać nasz czynnik wzrostu limfocyty T do podtrzymywania wzrostu linii limfocytów T.

A jeśli pozostawimy konkanawalinę A w formie wolnej, aktywuje ona komórki w momentach, w których nie chcemy ich aktywacji. Aby rozwiązać ten problem, dodamy nadmiar cukru, który zwiąże całą wolną konkanawalinę A. Dzięki temu zostanie ona całkowicie zniesieczona i nie będzie wiązać się z innymi glikozylowanymi receptorami na komórkach podczas dodawania TCGF do hodowli.

Zacznijmy zatem. Pierwszym krokiem w tym eksperymencie jest wyjęcie śledzion z szczurów bezpośrednio po eutanazji. To właśnie teraz zrobię, używając sterylnych narzędzi.

Gdy już wyjmę śledziony, umieścę je w PBS uzupełnionym o antybiotyki, a jako antybiotyki stosuję penicylinę i streptomycynę. Zacznijmy więc. Spryskuję szczura 70% etanolem, aby upewnić się, że w mojej hodowli nie pojawi się żadne zanieczyszczenie.

Następnie, używając narzędzi, wykonam niewielkie nacięcie skóry w tym miejscu. Następnie usuwam warstwę mięśni, a tutaj pojawia się śledziona. Używam zatem drugiej pęsety i delikatnie wyciągam śledzionę, uważając, aby jej nie uszkodzić.

W ten sposób usuwam tkankę łączną. Teraz mam śledzionę. Oczywiście bardzo uważam, aby nie uszkodzić żadnych innych struktur w jamie brzusznej, ponieważ jakiekolwiek uszkodzenie jelita doprowadziłoby do natychmiastowego zanieczyszczenia śledziony.

Następnie przeniosę śledzionę do probówki zawierającej PBS z dodatkiem antybiotyków. Probówkę tę będę przechowywać w lodzie. W ten sposób pobrałam już śledziony od trzech szczurów.

Jesteśmy zatem gotowi do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek z tych śledzion. Mając już śledziony, przeniosłam je do komory z laminarnym przepływem powietrza, aby przygotować z nich zawiesinę pojedynczych komórek, wykorzystując sita komórkowe o oczkach 70 µm. Do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek ze śledzion będę potrzebować kilku rzeczy.

Potrzebuję sterylnych narzędzi: jednej pęsety i jednych nożyczek. Następnie w szalce Petriego mam tłok sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml. Śledziony umieszczę w PBS z dodatkiem antybiotyków.

W drugiej szalce Petriego umieściłem sitko do komórek o oczkach 70 µm w 10 mL PBS z dodatkiem antybiotyków. Pierwszym krokiem jest upewnienie się, że śledziony są oczyszczone, ponieważ jak widać tutaj, znajdują się na nich wciąż małe fragmenty tkanki łącznej; usunę je, gdyż mogłyby one bardzo szybko zapchać sitko. W tym celu po prostu odcinam niepotrzebne części i wyrzucam je do pokrywki szalki Petriego.

Obecnie moje śledziony są w większości oczyszczone, więc będę wyjmować śledziony jedna po drugiej, umieszczać je w sitku do rozdrabniania komórek i kroić na małe kawałki. Następnie wymieszam wszystkie trzy śledziony. Kolejnym krokiem jest przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek. Oczywiście, ponieważ chcę zachować pełną sterylność, w ogóle nie dotykam sitka, lecz używam tłoka sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml, aby przecisnąć kawałki śledziony przez sitko.

Jak widać na zewnętrznej stronie urządzenia do rozdrabniania komórek, przygotowuję zawiesinę pojedynczych komórek. Na tym etapie wciąż widoczne są niewielkie fragmenty śledziony, ale już teraz pobieram zawiesinę pojedynczych komórek. Przeniosłem ją już do probówki 50 ml, którą przechowywałem w lodzie.

Następnie uzupełnię sitko do komórek kolejnymi 10 ml PBS z antybiotykami. Pobieram zatem około 10 ml PBS z antybiotykami; nie musi to być dokładnie 10 ml, ponieważ wykonujemy jedynie płukanie. Wlewam roztwór do sitka do komórek, a następnie stosuję tę samą procedurę.

Powracam do tłoka strzykawki i wyciskam nieco więcej zawiesiny. Oczywiście nie uda się przetłoczyć wszystkiego, ponieważ w sitku do komórek pozostaną tkanki łączone i małe fragmenty tłuszczu, których nie byłem w stanie usunąć. Należy jednak przenieść większość śledziony do sitka do komórek.

Następnie powtarzam dokładnie czynności wykonane wcześniej. Zbiorę zawiesinę pojedynczych komórek i dodam ją do tego samego zęba. W tym momencie w sitku do komórek nie zostało już prawie nic, a wypływający bufor PBS jest znacznie przejrzystszy. Po prostu wypłukam całość jeszcze raz i do tej pory powinniśmy uzyskać większość komórek.

Mam teraz zawiesinę pojedynczych komórek cytes PLE i zamierzam je odwirować, aby uzyskać osad. Wirowanie przez 8 do 10 minut będzie wystarczające. Odwirowaliśmy już komórki cytes PLE i otrzymaliśmy wyraźny osad.

W związku z tym usunę supernatant, a następnie przeprowadzę lizę erytrocytów. Zawiesinę miocytów będę resuspenderować w chlorku amonu. Jest to roztwór 0,15 M chlorku amonu i będę używać 5 ml na śledzionę.

Ponieważ posiadam trzy śledziony, użyję 15 ml chlorku amonu i będę przeprowadzać tę czynność w lodzie. Aby zlizować erytrocyty, będę delikatnie pipetować zawiesinę przez trzy minuty. Dobrze, użyjemy tego ujęcia z większą ekspozycją.

Analiza elektrocytów trwała trzy minuty. Teraz napełnię probówkę PBS-em, choć można również użyć pożywki. Ma to na celu przywrócenie osmolarności roztworu do zakresu normalnego dla tych komórek.

Następnie odwiruję komórki, tak jak zrobiłem to wcześniej, przez 8 do 10 minut, aby uzyskać osad. Potem przemyję je dwukrotnie, używając tego samego PBS z antybiotykami. Teraz odwirujemy komórki po uwalnianiu elektrocytów; nie należy się martwić, ponieważ nigdy nie udaje się uzyskać stuprocentowego uwolnienia elektrocytów.

Zatem osad nadal będzie czerwony, ale nadstaw będzie bardziej przejrzysty. Teraz wyleję nadstaw, zresuspenduję osad, dodam PBS do objętości 50 ml, odwiruję i powtórzę ten krok jeszcze raz, aby przeprowadzić dwa płukania. Następnie będę mógł policzyć komórki. Przemyłem miocyty dwukrotnie, a następnie zawiesiłem je w pożywce hodowlanej i policzyłem za pomocą cytometru.

Zgodnie z oczekiwaniami. Z trzech śledzion uzyskałem około 600 milionów komórek, co jest naturalne, ponieważ jedna śledziona daje zazwyczaj od 200 do 250 milionów komórek. Teraz wysieję komórki w zagęszczeniu 2 milionów na ml w pożywce uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej.

Do tego medium dodam 2 µg/ml koncentratu A, aby stymulować komórki. Następnie po prostu umieszczę komórki w inkubatorze na 48 h. Komórki znajdowały się w inkubatorze przez 48 h i, jak pokażę, urosły całkiem dobrze.

Pożywka zmieniła kolor na pomarańczowy. Jesteśmy zatem gotowi, aby zakończyć przygotowania do TCGF. Jak pamiętacie, dodałem kon carnaval do zawiesiny komórkowej w celu aktywacji komórek.

Zatem konkanawalina A jest lektyną. Będzie ona wiązać cukry we wszystkich receptorach komórki T, co doprowadzi do sztucznego pobudzenia wszystkich tych komórek. Problem, z którym teraz się mierzymy, polega na tym, że w supernatancie komórkowym wciąż znajduje się część konkanawaliny A.

Ponieważ zamierzamy użyć snat w innych kulturach limfocytów T do ekspansji komórek, nie chcemy, aby con carnaval in był obecny w tych kulturach. Aby go usunąć, dodam nadmiar cukru, z którym wiąże się con naval in, a jest to methyl alpha D cyte przedstawiony tutaj. Dodam nadmiar tego cukru i całkowicie go rozpuszczę.

Zwiąże to całą pozostałą konkanawalinę. Gdy to zostanie wykonane, poddam supernatanty komórkowe filtracji sterylnej i zamrożę aliquoty do wykorzystania w ciągu najbliższych kilku tygodni lub miesięcy. Przejdźmy zatem do tego ostatniego kroku. Przelewam supernatant z hodowli komórkowej do probówek o pojemności 50 ml, aby móc je odwirować i usunąć komórki.

Zatem po prostu napełniam tyle probówek, ile jest konieczne. Nie robię tego w komorze z laminarnym przepływem powietrza – mógłbym, ale ponieważ i tak na koniec muszę przefiltrować roztwór, gdyż dodaję cukier, który nie jest sterylny, robię to po prostu na blacie. Jest to łatwiejsze. Przelałem już wszystkie komórki i supernatant do probówek typu Falcon o pojemności 50 ml.

Przeniosę je teraz do wirówki i będę wirować przez około 10 minut. Jedynym powodem wirowania jest uzyskanie osadu z komórek, aby otrzymać klarowne nadsączniki. Komórki zostały już odwirowane, nadsącznik jest klarowny i to właśnie go chciałam zebrać.

Wszystkie nadsącz przelewam do czystej kolby o pojemności 150 cm². Do kolby dodaję cukier. W czasie wirowania komórek odważyłem ilość cukru niezbędną do uzyskania stężenia 15 mg/ml nadsączu.

Pozwolę mu całkowicie się rozpuścić, a następnie poddam supernatant filtracji sterylnej. Teraz dodam cukier w stężeniu 15 mg/ml supernatantu. Zakręcam naczynie i ponieważ nie pracuję w warunkach sterylnych, nie ma znaczenia, jeśli część roztworu dostanie się na zakrętkę; mieszam, aż cały cukier zostanie rozpuszczony.

To powinno pójść dość szybko. Tak, cały cukier jest już rozpuszczony. Teraz muszę jedynie przefiltrować supernatant przez filtr sterylny, a następnie podzielić go na alikwoty.

Zazwyczaj przygotowuję alikwoty o objętości 10–15 µL, które przechowuję w temperaturze -20°C. Takie alikwoty można przechowywać przez kilka miesięcy. Można również przechowywać TCGF w lodówce, jednak w takim przypadku należy go zużyć w ciągu kolejnych 10–15 dni.

W ciągu ostatnich dwóch dni pokazałem Państwu, jak przygotować czynnik wzrostu limfocytów T; ten nadsącz jest bardzo prosty i tani w przygotowaniu. Dlatego często stosujemy go w laboratorium do utrzymywania linii limfocytów T w kulturze, bez konieczności kupowania drogich koktajli cytokin. Życzę powodzenia w eksperymentach.