Izolacja związanych z rybosomami nowo powstałych polipeptydów in vitro w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej wzdłuż mRNA

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zidentyfikowanie i zlokalizowanie głównych miejsc pauzy translacyjnej dla mRNA translacyjnego w bezkomórkowym systemie translacji. Osiąga się to najpierw poprzez sklonowanie interesującego genu pod kontrolą promotora transkrypcyjnego T7. Następnie mRNA zostaje poddane transkrypcji i oczyszczeniu.

Następnie przeprowadza się translację in vitro w obecności mRNA i radioaktywnych aminokwasów w celu znakowania syntetyzowanego białka i nowo powstających polipeptydów. Na koniec polisomy są izolowane za pomocą wirowania w gradiencie gęstości (sedymentacji), a wyizolowane łańcuchy nascentne są rozdzielane metodą elektroforezy żelowej. W rezultacie, dzięki zastosowaniu elektroforezy SDS-PAGE w buforze Tristine oraz autoradiografii, można uzyskać wyniki wykazujące polipeptydy nascentne o różnych długościach, co wskazuje na obecność miejsc zatrzymania (pause sites) wzdłuż analizowanego mRNA.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z naszymi istniejącymi metodami, takimi jak mikrokokalowy test ochrony jądra, jest to, że jest ona niezwykle prosta, szybka i wydajna, a także pozwala na wyznaczenie i identyfikację głównych miejsc translacji wzdłuż dowolnego mRNA w danym systemie komórkowym. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na niektóre z kluczowych pytań w dziedzinie translacji i translacyjnego fałdowania białek, takich jak wpływ czynników komórkowych, np. wykorzystania kodonów, obfitości tRNA lub struktury drugorzędowej mRNA, na kinetykę translacji. Metoda ta może ponadto pomóc w zrozumieniu zależności między kinetyką translacji a kluczowymi etapami w ścieżce translacyjnego fałdowania białek.

Zastosowanie tej techniki rozciąga się na zrozumienie procesu fałdowania białek in vivo, który w przeważającej mierze uważa się za zachodzący kotranslacyjnie podczas translacji na rybosomach, choć niniejsze badanie obejmuje translację bezkomórkową gamma-krystaliny z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego ekstraktu komórkowego. Technikę tę można również zastosować do identyfikacji elementów IDE translacyjnych w potencjalnie dowolnym białku, używając ekstraktu zdolnego do translacji, przygotowanego z dowolnego źródła komórkowego. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności na dwóch kluczowych etapach protokołu.

Pierwszym krokiem jest ustalenie całkowitego czasu wymaganego do przeprowadzenia reakcji translacji, co zapewni, że większość powstających polipeptydów pozostanie związana z rybosomem. Drugim krokiem jest znalezienie odpowiedniego układu do rozdzielenia większości powstających polipeptydów; wybór układu zależy od wielkości badanego białka. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy w połowie lat osiemdziesiątych postanowiliśmy zbadać kinetykę translacji cząsteczek globiny w odniesieniu do proponowanego modelu kotranslacyjnego fałdowania globiny.

Niejednorodność translacji globiny została po raz pierwszy zauważona przez PRO i Maurice'a w 1974 roku podczas zastosowania chromatografii CLO z wykluczaniem wielkości w celu analizy NAS i łańcuchów globiny. Jednakże ich analiza nie charakteryzowała się pożądaną precyzją; Pro i more zaobserwowali cztery główne miejsca zatrzymania translacji podczas procesu translacji globiny. Następnie nasza analiza pozwoliła na ujawnienie około 10 dodatkowych miejsc zatrzymania i zbudowanie szczegółowego modelu fałdowania globiny podczas translacji. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ opisana tutaj technika obejmuje izolację polisomów oraz analizę powstających polipeptydów przy użyciu żelu SDS-PAGE w buforze Tris.

Oba te kroki są kluczowe dla uzyskania wysokiej jakości i powtarzalnych wyników. Procedurę zaprezentuje student studiów doktoranckich z laboratorium Myelo, Sujata, w celu przeprowadzenia transkrypcji in vitro mRNA. Należy rozpocząć od genu docelowego, który został sklonowany pod promotorem T7 i/lub SP6; za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego należy zlinearyzować matrycę DNA poniżej kodonu stop i/lub 3' końca mRNA.

Próbkę po trawieniu enzymami restrykcyjnymi poddaje się elektroforezie w żelu agarozowym, aby zweryfikować, czy DNA zostało całkowicie zlinearyzowane. Po ustaleniu optymalnego stężenia matrycy DNA należy wykorzystać zestaw do transkrypcji w celu przeprowadzenia transkrypcji in vitro mRNA zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie w celu oczyszczenia mRNA należy zastosować wytrącanie chlorkiem litu.

Następnie należy wykorzystać elektroforezę w żelu akryloamidowym lub żelu agarosem w celu potwierdzenia czystości produktu. Przygotować 100 µL reakcji translacji in vitro w wodzie wolnej od nukleaz, dodając 1 mM mieszaninę aminokwasów bez metioniny, 10 jednostek inhibitora RNA, 20 µCi radioaktywnej 35 S metioniny oraz lizat retikulocytów królika. Następnie należy ogrzać reakcję, inkubując ją w temperaturze 30 °C przez pięć minut.

Następnie należy dodać 2 µg mRNA i inkubować w temperaturze 30 °C przez 5 minut w celu zatrzymania reakcji, a następnie umieścić próbkę na lodzie, aby wyizolować nowo powstałe polipeptydy związane z rybosomami. Mieszaninę reakcyjną translacji należy nanieść na 4,5 ml 30% glicerolu w buforze Tris-HCl pH 7,6 z dodatkiem chlorku potasu i chlorku magnezu, a następnie wirować w wirówce z rotorem TLA 110 przy 100 000 ×g przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C. Następnie należy ostrożnie usunąć nadsącz i resuspender osad polisomalny zawierający nowo powstałe polipeptydy w niewielkiej objętości 1 mM buforu Tris-HCl pH 7,6 zawierającego 0,5 mg/ml rybonukleazy A i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.

Aby przyspieszyć hydrolizę wiązania estrowego tRNA w peptydzie, należy dodać do reakcji wodorotlenek sodu do stężenia końcowego 10 millimolar i inkubować przez dodatkowe 30 minut. Nowo powstałe polipeptydy należy rozdzielić za pomocą żelu SDS-PAGE w buforze Tris-Tricine, a następnie utrwalić i wysuszyć żele. Żele należy poddać autoradiografii, a następnie obrazowaniu fosforowemu w celu detekcji nowo powstałych polipeptydów.

Zmiana ruchu rybosomów wywołana zmianami w puli tRNA powinna prowadzić do zmian w rozkładzie wielkości nascentnych polipeptydów gromadzących się podczas translacji, a także w ich względnych intensywnościach, które odzwierciedlają czas trwania pauzy w danym miejscu. Nascentne polipeptydy białka krystaliny gamma B zostały wyizolowane i rozdzielone za pomocą elektroforezy Tristine SDS-PAGE. Nieidentyczne długości i intensywności polipeptydów w systemach RRL oraz e coli wskazują, że ruch rybosomów wzdłuż mRNA w tych dwóch systemach przebiega zgodnie z różną kinetyką translacji.

Na przykład należy zwrócić uwagę na wyraźny prążek 17,7 kilodalton w lizacie e coli, który nie występuje w systemie lizatu retikulocytów królika. Krystalina gamma B posiada tandemowe kodony argininy, które są częste w systemach ssaków, ale wiadomo, że są niezwykle rzadkie i powolnie translacyjne w e coli, co sugeruje, że prążek ten jest spowodowany pauzą rybosomu na tych tandemowych rzadkich kodonach, jak pokazano tutaj.

W przypadku braku mRNA nie obserwuje się żadnych prążków, a traktowanie puromycyną usuwa większość łańcuchów powstających z polisomów. Ponadto przedłużone traktowanie puromycyną usuwa wszystkie łańcuchy powstające, co potwierdza, że obserwowane produkty polipeptydowe są łańcuchami powstającymi związanymi z rybosomami, a nie białkami MRP współosadzającymi się z polisomami. Po opanowaniu technika ta może być wykonana w ciągu jednego do dwóch dni. Czas trwania procedury zależy głównie od czasu trwania etapu wirowania oraz etapu elektroforezy żelowej peptydów powstających.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest natychmiastowe przerwanie reakcji translacji po upływie czasu inkubacji. Aby zapobiec uwolnieniu powstającego polipeptydu z rybosomu, kluczowe jest unikanie kontaktu z RNA na każdym etapie. Zanieczyszczenie RNA może wpłynąć na wydajność translacji ekstraktu i prowadzić do uwolnienia powstającego polipeptydu z rybosomu podczas stosowania tej procedury.

Inne cele, takie jak na przykład wpływ białek wiążących mRNA na wydajność ruchu rybosomu na danej matrycy, mogą zostać przetestowane po opracowaniu tej metody. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie fałdowania białek do zbadania roli pauzy translacyjnej wynikającej z obecności rzadkich kodonów w procesie translacyjnego fałdowania białek. Metoda ta została wcześniej wykorzystana do zbadania roli substytucji kodonów w ruchu rybosomu na matrycy oraz w translacyjnym fałdowaniu białek.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak identyfikować miejsca translacyjne w mRNA poprzez izolację nowo powstałych polipeptydów związanych z rybosomem. Należy pamiętać, że praca z izotopami promieniotwórczymi i znakowanymi aminokwasami, takimi jak na przykład ³⁵S-metionina, wymaga szczególnych środków ostrożności, co zawsze powinno być uwzględnione podczas wykonywania tej procedury.