Protokół pobierania trzustki ludzkiej

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie sekcji trzustki ludzkiej w sposób zachowujący orientację anatomiczną. Osiąga się to poprzez oddzielenie dwunastnicy i śledziony od trzustki, a następnie usunięcie nadmiaru tkanki tłuszczowej oraz naczyń krwionośnych z narządu. Drugim krokiem jest pomalowanie powierzchni przedniej niebieskim tuszem, a powierzchni tylnej czarnym tuszem.

Następnie trzustkę dzieli się na trzy obszary. Każdy obszar jest następnie krojony w poprzek na równe plastry i umieszczany w kasetkach do parafiny, formach OCT lub rozdrabniany i przenoszony do probówek. W końcowym etapie próbki są pobierane z trzech obszarów trzustki, przy jednoczesnym zachowaniu prawidłowej orientacji anatomicznej na potrzeby przyszłych analiz.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad cukrzycą typu pierwszego, takie jak mechanizmy leżące u podstaw utraty masy lub funkcji komórek beta, a także charakter ataku komórek odpornościowych. Wizualna prezentacja metody przetwarzania trzustki jest kluczowa, ponieważ zachowanie orientacji trzustki in vivo wymaga dbałości o szczegóły. Procedurę zaprezentują Linda Snyder, histotechnik oraz Emily Montgomery, naukowiec biologiczny w moim laboratorium.

Należy rozpocząć od przygotowania wszystkich materiałów niezbędnych do przeprowadzenia procedury. Najpierw należy opisać kasety, w których znajdą się bloki parafinowe, podając identyfikator dawcy, rodzaj próbki, numer alikwoty oraz wszelkie dodatkowe informacje. Następnie w ten sam sposób należy opisać formy OCT.

Wytnij odpowiednią liczbę kawałków folii aluminiowej do owinięcia każdego bloczka OCT i odłóż je do późniejszego użycia. Przygotuj wszystkie probówki niezbędne do przechowywania próbek świeżych i zamrożonych. W odpowiednim momencie dodaj RNA later oraz pożywkę RPMI.

Następnie należy przygotować obszary robocze, umieszczając deski sekcyjne, wysterylizowane narzędzia oraz wszystkie pozostałe materiały niezbędne do procedury zarówno w komorze z laminarnym przepływem powietrza, jak i na blacie roboczym. Wszystkie kasety i formy OCT należy ułożyć w kolejności użycia w zasięgu ręki. Przygotować kąpiel mrożącą, dolewając odpowiednią ilość izopentanu, aby przykryć suchy lód na dnie styropianowego pudełka.

Aby rozpocząć sekcję, należy usunąć dwunastnicę i śledzionę. Należy zacząć od oddzielania dwunastnicy od trzustki na jednym z jej końców i kontynuować czynność aż do całkowitego rozdzielenia tych organów. Śledziona jest przytwierdzona luźno, przez co można ją łatwo oddzielić od tkanki tłuszczowej i trzustki.

Następnie należy oczyścić trzustkę z nadmiaru tkanki tłuszczowej, naczyń i nerwów, stosując kombinację tępej i ostrej dyssekcji. Odłożyć tłuszcz oraz węzły chłonne w celu ich późniejszej obróbki. Po oczyszczeniu umieścić trzustkę na stole sekcyjnym wyłożonym ręcznikami papierowymi.

Zachowanie prawidłowej orientacji trzustki jest najtrudniejszym elementem tej procedury. Aby zapewnić sukces, powierzchnie przednią i tylną oznacza się tuszami w różnych kolorach. Zanurz aplikator z bawełnianą końcówką w niebieskim tuszu, rozprowadź go na powierzchni przedniej trzustki, a następnie odsącz nadmiar.

Następnie zanurz nowy aplikator w czarnym tuszu i rozprowadź go na tylnej powierzchni trzustki. Przywróć trzustkę do jej normalnej orientacji. Z powierzchnią przednią skierowaną do góry trzustka jest teraz gotowa do pocięcia na trzy sekcje.

Najpierw przetnij miejsce połączenia głowy z trzonem. Następnie podziel pozostałą część na w przybliżeniu równe fragmenty, aby oddzielić trzon od ogona, a następnie zmierz i zapisz masę każdego z obszarów trzustki, zaczynając od sekcji głowy.

Podziel każdy region na sekcje o długości około 0.5 centymetra, wykonując cięcia poprzeczne, podobnie jak przy krojeniu bochenka chleba. Po pokrojeniu każdego regionu trzustki odetnij ostatnią sekcję regionu głowy, która jest sekcją połączenia głowy z trzonem, i umieść ją na oddzielnej desce sekcyjnej. Posiekaj tę sekcję na małe kawałki i rozdziel je równomiernie pomiędzy oznakowane probówki kriogeniczne z RNA i bez RNA.

Następnie probówki zostają zamrożone zgodnie ze standardowymi procedurami. Powtórz tę procedurę dla sekcji połączenia ciała z ogonem.

Po zebraniu posiekanych próbek należy przechylić wszystkie przekroje poprzeczne w prawo. Następnie usuwa się naprzemienne przekroje z każdego regionu. W przypadku bloków parafinowych i OCT należy usunąć pierwszy przekrój dla blokowania parafiną.

Jeśli sekcja jest zbyt duża, należy przeciąć ją na pół. Kasety należy oznaczyć jako A i B. Jeśli fragment nadal jest zbyt duży, należy przeciąć każdą sekcję prostopadle do poprzedniego cięcia, a następnie oznaczyć kasety od A do D zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Jak widać tutaj, należy ustawić kasetę tak, aby etykieta znajdowała się po lewej stronie.

Następnie umieść tkankę w kasecie i zamknij pokrywę. Przenieś kasetę do pojemnika z neutralnym buforem formaliny. Ponumeruj bloki sekwencyjnie w obrębie każdego regionu, zaczynając od sekcji najbardziej przyśrodkowej w przypadku bloków OCT.

Wlej cienką warstwę medium OCT do wcześniej oznakowanego modelu. Przed wprowadzeniem tkanki pokryj ją medium OCT i szybko zamroź próbkę do późniejszego wykorzystania, wracając do tkanki odłożonej wcześniej. Wyizoluj węzły chłonne trzustki, odcinając tłuszcz i tkankę łączną otaczającą torebkę węzła. Umieść węzły w sterylnym naczyniu zawierającym DMEF; duże węzły rozdrabnij na kawałki nie większe niż 0.5 centymetrów.

Po wyizolowaniu węzłów chłonnych trzustki należy podzielić tkankę pomiędzy przygotowane probówki i kasety do dalszej obróbki. Po opracowaniu węzłów chłonnych śledzionę należy posiekać i przechowywać w podobny sposób. W celu opracowania dwunastnicy należy użyć zwilżonego gazika do oczyszczenia błony śluzowej z treści śluzowej, odciąć błonę śluzową, a następnie pociąć ją na sekcje.

Podziel próbki błony śluzowej zgodnie z wcześniejszym opisem. Stosując tę procedurę, pobiera się reprezentatywne próbki z każdego obszaru trzustki, co przedstawiono tutaj. Masa tkanek z głowy, trzonu i ogona była w przybliżeniu taka sama.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przetwarzać ludzką trzustkę na różne rodzaje próbek, w szczególności w zakresie zachowania ich orientacji, a także wiedzieć, jak izolować węzły chłonne z tłuszczu okołotrzustkowego.