Izolacja i charakterystyka komórek dendrytycznych oraz makrofagów z jelit myszy

Ogólnym celem tej procedury jest szybka izolacja komórek dendrytycznych (dcs) oraz makrofagów z jelit myszy w celu ich charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej. Osiąga się to najpierw poprzez pobranie tkanki jelitowej. Drugim krokiem jest oddzielenie nabłonka jelitowego od blaszki właściwej.

Następnie, w końcowych etapach procedury, przeprowadzany jest trawienie blaszki właściwej jelita. Komórki blaszki właściwej są barwione fluorescencyjnie za pomocą koniugowanych przeciwciał, a następnie poddawane bramkowaniu w celu wyodrębnienia specyficznych populacji komórkowych. W efekcie populacje komórek dendrytycznych jelit oraz makrofagów mogą zostać dokładniej scharakteryzowane i oczyszczone do badań funkcjonalnych w celu oceny produkcji cytokin, prezentacji antygenów oraz regulacji komórek odpornościowych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że szybkość trawienia tkanek zapewnia optymalną ekspresję antygenów powierzchniowych komórek, żywotność komórek oraz ich integralność komórkową. Po eutanazji myszy i potwierdzeniu zgonu za pomocą odruchu uciskania palca, spryskać brzuch i klatkę piersiową zwierzęcia 70% ethanol. Następnie za pomocą nożyczek wykonać niewielkie poziome nacięcie na środku brzucha i odsunąć skórę, aby odsłonić otrzewną.

Otwórz otrzewną za pomocą nożyczek, wykonując nacięcie w okolicy zwieracza odbytu, aby oddzielić żołądek od górnego odcinka jelita cienkiego, a następnie użyj pęsety do odsunięcia krezki. Wykonaj kolejne nacięcie w okolicy zastawki kątniczo-krętniczej, aby uwolnić całe jelito cienkie z jelita grubego. Kontynuuj oddzielanie krezki od jelita grubego i wykonaj nacięcie w obrębie brzegu odbytu.

Za pomocą nożyczek rozciąć okrężnicę wzdłużnie, a następnie użyć C-M-F-P-B-S w temperaturze pokojowej, aby wypłukać treść kałową i śluz za światła jelita. Następnie, używając nożyczek i pęsety, makroskopowo wypreparować plamy Peyer'a wzdłuż powierzchni antymezerycznej jelita cienkiego, a następnie rozciąć jelito cienkie wzdłużnie.

Następnie oczyść światło jelita cienkiego z treści kałowej i śluzu, używając kolejnej porcji C-M-F-P-B-S w temperaturze pokojowej. Oddzielnie potnij jelita cienkie i grube na kawałki o długości około 1,5 centymetra i umieść je w oddzielnych probówkach stożkowych o pojemności 50 mililitrów zawierających 30 mililitrów podgrzanego C-M-F-H-B-S-S z FBS oraz 2 millimolar EDTA. Umieść każdą probówkę stożkową 50 mililitrów poziomo w wytrząsaczu orbitalnym, wytrząsając probówki z prędkością 250 RPM przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie umieść pojedyncze sito z drucianej siatki nad naczyniem na odpady. Przelej zawartość każdej probówki stożkowej o pojemności 50 ml przez siatkę, aby odzyskać fragmenty jelita, a następnie umieść je w nowych, oddzielnych probówkach stożkowych o pojemności 50 ml zawierających 30 ml podgrzanego Prewarm C-M-F-H-B-S-S z FBS i 2 mM EDTA. Na koniec umieść probówki z powrotem w inkubatorze orbitalnym na kolejne 20 minut.

Po drugiej serii wstrząsania przelać zawartość każdej probówki przez sitko. Ponownie osuszyć nadmiar medium za pomocą ręcznika papierowego, a następnie przenieść fragmenty jelita do małej plastikowej łódki do odważania. Najtrudniejszym elementem tej techniki jest trawienie tkanki; aby zapewnić sukces, należy wziąć pod uwagę wszystkie parametry: czas trwania trawienia, właściwości kolagenazy, integralność tkanki oraz rozmiar trawionej tkanki, wykorzystując do tego nożyczki w szybki sposób.

Posiekaj fragmenty jelita, a następnie dodaj rozdrobnioną tkankę do 50 mililitrowej probówki stożkowej zawierającej 20 ml roztworu kolagenazy. Umieść probówkę poziomo w wytrząsarku orbitalnym i traw fragmenty jelita przy 200 RPM przez 10 do 20 minut w temperaturze 37°C. Następnie krótko wymieszaj zawartość probówki w wortexie, aby zapewnić całkowitą dysocjację pozostałej tkanki jelitowej, a potem przefiltruj zawiesinę komórkową przez sito komórkowe o oczkach 100 µm bezpośrednio do 50 mililitrowej probówki stożkowej.

Na koniec dopełnić probówkę stożkową po brzegi pożywką C-M-F-H-B-S-S z FBS, a następnie dwukrotnie odwirować zawiesinę komórkową przez pięć minut przy 425 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odlać supernatant i resuspender osad komórkowy w lodowatej pożywce C-M-F-H-B-S-S z FBS, a próbki umieścić na lodzie. Następnie przeprowadzić barwienie komórek pod kątem wybranych białek powierzchniowych.

Zacznij od stworzenia wykresu kropkowego z wykluczeniem komórek wykazujących pozytywny wynik barwienia na martwe komórki, zgodnie z prezentacją w tym miejscu. Następnie wyklucz zdarzenia podwójne (doublety), jak pokazano tutaj i tutaj. Teraz wykorzystaj kanały rozproszenia światła w przód i w bok, aby wyznaczyć bramkę dla interesujących nas komórek, pamiętając o wykluczeniu zanieczyszczeń (debris).

Następnie należy utworzyć kolejny wykres kropkowy (dot plot), bramkując komórki pozytywne pod kątem antygenów CD 45 i IAB. Na osobnym wykresie kropkowym dla komórek prezentujących antygeny należy wyznaczyć regiony pozwalające na rozróżnienie specyficznych subpopulacji komórek dendrytycznych (DC) i makrofagów. Przedstawiony tutaj region R1 obejmuje komórki CD 11 C pozytywne i CD 11 B słabo negatywne.

Region R two wyznacza komórki o podobnym poziomie ekspresji powierzchniowej CD 11 C jak komórki w regionie R one, ale które wykazują również ekspresję CD 11 B. Regiony R three oznaczają komórki CD 11 B-pozytywne i CD 11 C słabo negatywne. Te trzy regiony mogą być dalej analizowane pod kątem ekspresji F four 80 i CD 1 0 3 w celu odróżnienia odpowiednio populacji makrofagów i DC. Jak widać na tym wykresie punktowym, komórki CD 11 C-pozytywne i CD 11 B słabo negatywne w regionie R one będą wykazywać wysoki poziom alpha ein CD 1 0 3 oraz niski poziom F four 80.

Ten wykres kropkowy pokazuje, że komórki CD 11 B dodatnie i CD 11 C dodatnie w regionie R dwa będą składać się zarówno z DCS, jak i makrofagów, na podstawie ich dychotomicznej ekspresji CD 1 0 3 i F cztery 80. Wreszcie, na podstawie fenotypowego profilu F cztery 80 dodatniego i CD 1 0 3 ujemnego R trzy, bramkowane komórki CD 11 B dodatnie i CD 11 C del ujemne będą składać się z makrofagów. Zależność między czasem trawienia tkanki a całkowitą wydajnością komórek oraz ekspresją CD 11 B i CD 11 C została przedstawiona na następnych sześciu rysunkach. Tkanka jelitowa trawiona przez trzy minuty daje niską całkowitą liczbę komórek, co skutkuje niewielką liczbą dostępnych do charakterystyki DCS i makrofagów. Trawienie tkanki przez 11 minut zapewnia wysoką wydajność żywych komórek, dając populacje DCS i makrofagów wykazujące wysoką ekspresję CD 11 B i CD 11 C, które są od siebie odróżnialne fenotypowo.

Z kolei trawienie przez 50 minut daje podobną wydajność komórek w porównaniu z trawieniem zoptymalizowanym. Jednakże rozróżnienie różnych populacji komórek przy użyciu CD 11 B i CD 11 C staje się trudniejsze, ponieważ ekspresja CD 11 C ulega zmniejszeniu, a liczba martwych komórek wzrasta.

Dzięki optymalizacji parametrów trawienia tkanki jelitowej można szybko uzyskać wysoką wydajność komórek. W konsekwencji szybka izolacja komórek dendrytycznych i makrofagów z jelit myszy może być przydatna do oceny właściwości funkcjonalnych komórek odpornościowych z zachowanymi antygenami powierzchniowymi.