Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

W tym filmie opisujemy efektywną pod względem czasu i kosztów procedurę ekspresji białek wydzielniczych z linii komórkowych HEK 293T. Początkowo, w płytce sześciodołkowej, przygotowywana jest hodowla komórek HEK 293T o 40% konfluencji. Następnie przygotowuje się mieszaninę do transfekcji poprzez rozcieńczenie GeneJuice, a następnie plazmidów testowych w medium bezsurowiczym.

Mieszaninę do transfekcji nanosi się na komórki, które następnie inkubuje się w temperaturze 37 °C, aby umożliwić ekspresję białka. Wykrywanie białka w nadnadczynie można przeprowadzić za pomocą metody western blot. Po zidentyfikowaniu odpowiedniego konstruktu procedurę można przeskalować, wykorzystując 10-warstwowe fabryki komórkowe.

Komórki są transfekowane z użyciem PEI jako odczynnika do transfekcji. Białko można odzyskiwać z supernatantów hodowli, stosując filtrację przepływową styczną, a następnie chromatografię powinowactwa. Ostatecznie platforma ta pozwala na ekspresję szerokiego zakresu makrocząsteczek w ilościach liczonych w miligramach.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak ekspresja w komórkach owadzich oparta na wirusach baculowirusowych, jest możliwość przesiewania i skalowania dużej liczby konstruktów w celu uzyskania ekspresji w ciągu zaledwie trzech tygodni. Procedurę tę zaprezentują Hello Aiden, Shada Zini oraz Jonathan Cook, trzej doktoranci z mojego laboratorium. Rozpocznij od wysiania 250 000 komórek HEK 293T na dołek w objętości 1 mL w płytce 6-dołkowej; dodaj 1 mL na dołek pożywki DMEM uzupełnionej o 10% FBS i penstre, a następnie zakręć płytką, aby równomiernie rozprzestrzenić komórki.

Następnie inkubuj komórki przez noc w inkubatorze z wilgotnym powietrzem i 5% carbon dioxide w temperaturze 37 stopni Celsius. Gdy komórki osiągną konfluencję na poziomie około 40%, zastąp supernatant dwoma mililitrami świeżej pożywki, aby przygotować mieszaninę do transfekcji. Najpierw odmierz 90 mikrolitrów serum-free DMEM do probówki typu eppendorf.

Następnie należy dodać 3 µL GeneJuice, odczynnika do transfekcji, delikatnie wymieszać zawartość probówki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie dodać 10 µL roztworu zapasowego oczyszczonego plazmidowego DNA z mini-prepu o stężeniu 100 ng/µL, który ma zostać poddany transfekcji.

Wymieszaj zawartość probówki i pozostaw w temperaturze pokojowej na 15 minut. Aby przeprowadzić transfekcję, nanieś mieszaninę na komórki HEC 2 9 3 T. Kropla po kropli, delikatnie kołysz płytką, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę do transfekcji.

Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach dodaj 1 ml świeżej pożywki do każdej studzienki i inkubuj przez kolejne 48 godzin. Trzy dni po transfekcji zbierz supernatant i określ poziomy ekspresji białka docelowego za pomocą metody western blot.

Po zidentyfikowaniu odpowiedniego konstruktu można zwiększyć skalę procedury transfekcji. Używając 10-warstwowych fabryk komórek, należy napełnić fabrykę 1,2 litrami DMEM uzupełnionego o 5% FBS. Następnie dodaje się 200 milionów komórek HEC 2 9 3 T, rozdzielając je równomiernie na wszystkie warstwy.

Cztery kolby do hodowli komórkowych T 225 cm², hodowane do 100% konfluencji, zawierają około 200 milionów komórek. Inkubuj komórki w temperaturze 37°C przez noc. Przygotuj mieszaninę do transfekcji w kolbie T 75, rozcieńczając 840 µg DNA w 84 ml sterylnego 1× PBS.

Dodaj 2,5 ml roztworu polietyleniminy (PEI) o stężeniu 1 mg/ml i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Roztwór powinien stać się mętny. Następnie powoli wlej mieszaninę do transfekcji do cell factory i dokładnie ją rozprowadź.

Warstwy ogólne. Dodaj kwas walproowy do końcowego stężenia 4 mM. Zwiększy to wydajność ekspresji po dodaniu mieszaniny do transfekcji.

Inkubować hodowlę w temperaturze 37°C przez cztery dni, aby umożliwić ekspresję białka. Zebrać pożywkę cztery dni po transfekcji i niezwłocznie oczyścić fabrykę komórkową w celu ponownego użycia; odwirować zebraną pożywkę przy 6 000 G przez 30 minut w temperaturze 4°C, a następnie przefiltrować ją przez aparat do filtracji próżniowej z filtrem sterylnym 0,22 μm, aby usunąć wszelkie cząstki stałe. Następnie użyć systemu tangentialnej filtracji przepływowej Centra Mate, aby skoncentrować nadsącz do objętości 75 ml.

Po skoncentrowaniu nadsączu białko docelowe można oczyścić za pomocą chromatografii powinowactwa. W tym doświadczeniu oczyszczono podjednostki z przyłączonymm tagiem HA domeny zewnątrzkomórkowej ludzkich receptorów AAL two, wykorzystując opisany tutaj system wielkoskalowy, a następnie chromatografię o wysokim powinowactwie przeciwko THA. Wykazano to w analizie SDS-PAGE barwionej kumasy.

Domeny pozakomórkowe podjednostek alfa i gamma receptora interleukiny 2 migrują przy masach cząsteczkowych 40 kilodaltonów i 46 kilodaltonów. Heterogeniczność glikanów EnLink obecnych na IL two R alpha i IL two R gamma spowodowała poszerzenie prążków na żelu SDS-PAGE. Prążek o wyższej masie cząsteczkowej reprezentuje zanieczyszczającą BSA.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać sprawiedliwą wiedzę na temat tego, jak ekspresować białka z ludzkich hodowli komórkowych przy użyciu 10-warstwowych fabryk komórkowych. Należy pamiętać, że komórki HC 2 93 T są uważane za materiał biologicznie niebezpieczny i powinny być obsługiwane na drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Prosimy o stałe noszenie odpowiedniej odzieży ochronnej; powierzchnie powinny być dezynfekowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i rządowymi.