Pomiar kinetyki progresji cyklu komórkowego z wykorzystaniem znakowania metabolicznego i cytometrii przepływowej

Ogólnym celem następującej procedury jest pomiar kinetyki i przebiegu cyklu komórkowego. Najpierw komórki poddawane są znakowaniu metodą pulse-chase przy użyciu romo, deoxyurydyny lub BrDU, które zostają włączone do DNA komórek w miejsce tymidyny. Następnie komórki poddawane są immunobarwieniu przeciwciałami przeciwko BrDU i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej bezpośrednio po barwieniu.

Jedynie komórki w fazie S zostają oznakowane, a następnie przechodzą one przez cykl komórkowy do fazy G2. Po mitozie są one wykrywane jako komórki o zawartości DNA równej 4N. Zawartość DNA jest następnie redukowana do 2N. W związku z tym analiza profili fluorescencji uzyskanych metodą cytometrii przepływowej może być wykorzystana do określenia kinetyki progresji cyklu komórkowego.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi protokołami wykorzystującymi związki chemiczne do synchronizacji komórek jest brak zaburzeń fizjologicznych, które mogłyby niezamierzenie wpłynąć na mechanizm podziału komórkowego. Po raz pierwszy zastosowaliśmy tę metodę, gdy nasze próby badania tempa progresji cyklu komórkowego przy użyciu synchronizacji chemicznej przyniosły nieoczekiwane wyniki, które zakłócały naszą analizę. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki.

Na przykład, co jest podstawą różnic w tempie wzrostu między różnymi typami komórek? Aby to zbadać, rozpocznij ten protokół od znakowania impulsowego (pulse-chase) komórek BRDU. Zacznij od przygotowania jednej płytki o średnicy 10 centymetrów dla każdego punktu czasowego oraz jednej dla każdej z poniższych kontroli.

wyłącznie BRDU, wyłącznie PI, BRDU negatywne, PI negatywne. Wysiać na każdą płytkę 5 × 10⁵ komórek MCF-7 w uzupełnionym medium DMEM. Inkubować płytki przez 24 do 48 godzin, aby umożliwić komórkom regenerację i przytwierdzenie. Po osiągnięciu przez komórki 60% konfluencji, wymienić medium na świeże DMEM zawierające 10 µM.

Inkubuj komórki z BrdU przez jedną godzinę w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2, aby umożliwić wbudowanie BrdU do DNA. Należy pozostawić jedną płytkę niepoddaną działaniu odczynnika, aby służyła jako kontrola negatywna lub punkt czasowy zero po upływie jednej godziny. Usuń podłoże do znakowania impulsowego i krótko przepłucz komórki buforem PBS w punktach czasowych od dwóch do ośmiu godzin.

Dodać świeżą pożywkę wzrostową i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze. Następnie niezwłocznie zebrać materiał z płytek dla punktów czasowych zero i jednej godziny, zgodnie z opisem w następnej sekcji. Aby zebrać komórki, należy odessać pożywkę i przepłukać płytkę.

Najpierw opłucz komórki roztworem PBS, a następnie zastosuj trypsynę, aby odłączyć je od płytki. Zbierz komórki w pożywce DMEM i odwiruj przy 390 ×g przez pięć minut. Odlej nadsącz. Następnie przemyj komórki 1–5 ml lodowatego PBS i odwiruj przy 390 ×g przez pięć minut. Po wirowaniu odlej nadsącz i resuspenduj komórki w 100 µl lodu.

Zimny PBS zawierający 1% FBS. FBS pomaga zapobiegać agregacji komórek. Jednym z najważniejszych aspektów tej procedury jest zapewnienie otrzymania zawiesiny pojedynczych komórek z zebranego materiału komórkowego.

W celu utrwalenia próbek należy dodawać komórki bezpośrednio do etanolu, kropla po kropli. Jest to etap krytyczny. Następnie, aby unieruchomić komórki, należy za pomocą pipety dodawać je kroplami do 5 mL schłodzonego do temperatury lodu roztworu.

70% etanol w 15 mililitrowej probówce stożkowej. Inkubować komórki na lodzie przez 30 minut lub przechowywać je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Jest to idealny moment na przerwanie pobierania próbek z różnych punktów czasowych; próbki mogą pozostawać w etanolu przez kilka dni, co pozwala na ich jednoczesne przetworzenie w pozostałych etapach protokołu w celu przeprowadzenia barwienia BRDU oraz jodkiem propidyny.

Wyjąć komórki z temperatury 4°C i wirować je przy 90×g przez 5 minut (trzykrotnie). Po wirowaniu odessać większość utrwalacza, pozostawiając około 50 µL. Następnie wymieszać na vortexie.

Aby rozluźnić pellet w celu denaturacji DNA podczas mieszania w wstrząsarzu wirówkowym. Powoli, kroplami, dodać 1 mL 2N HCl z Tritonem X 100, a następnie inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Zpelletować komórki, wirując próbki przez 5 minut przy 390 ×g, po czym odessać i usunąć nadsącz.

Następnie resuspenduj pellet komórkowy w jednym mililitrze 0,1 molarnego boranu sodu. Po odwirowaniu ponownie odessać i usunąć nadsącz. Następnie resuspenduj pellet komórkowy w 75 mikrolitrach barwnika BRDU.

Mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 45 minut, chroniąc ją przed światłem po zakończeniu inkubacji. Komórki odwirowano w sposób opisany wcześniej, a osad komórkowy zawieszono w jednym mililitrze PBS zawierającego pięć mikrogramów na mililitr jodku propidyny. Podczas analizy próbki dodatniej pod kątem PI w cytometrze przepływowym, należy utworzyć wykres rozrzutu scatter (FSC vs SSC), aby upewnić się co do prawidłowego rozkładu wielkości komórek.

Oba te parametry należy przedstawić na skali liniowej. Jednocześnie należy wyświetlić wykres FL three H względem FL two W, aby przeanalizować barwienie PI w odniesieniu do szerokości impulsu fluorescencji. Wykres ten służy do stworzenia bramki w celu wyizolowania frakcji komórek, które uznaje się za mieszczące się w normalnym wzorcu rozkładu cyklu komórkowego.

Ogólnie ten wzorzec rozkładu charakteryzuje się dwiema grupami komórek z dwiema i czterema zawartościami NDNA po barwieniu PI, reprezentującymi odpowiednio fazy G1 i G2 cyklu komórkowego. Ciąg komórek znajdujący się pomiędzy tymi dwiema grupami reprezentuje trwającą replikację DNA, która zachodzi w fazie S cyklu komórkowego. Utwórz wykres przedstawiający wyselekcjonowane komórki z FL1-H lub FITC w skali logarytmicznej na osi Y oraz PI w skali liniowej na osi X.

Wykres ten posłuży do ustawienia pozostałych parametrów za pomocą różnych elementów sterujących, a także do zbierania danych. W celu przeprowadzenia analizy należy umieścić próbkę barwioną wyłącznie PI w porcie załadowania cytometru przepływowego i dostosować wzmocnienie tak, aby G1 znajdowało się na poziomie około 200 na osi x. Będzie to łatwiejsze do zwizualizowania na wykresie histogramu barwienia PI.

Następnie umieść próbkę zawierającą wyłącznie BRDU w porcie załadunkowym i uruchom pomiar. Dostosuj wzmocnienie w taki sposób, aby na wykresie pojawiły się dwie populacje komórek: BRDU-dodatnie oraz BRDU-ujemne. W idealnym przypadku komórki BRDU-ujemne powinny znajdować się dokładnie na poziomie 10¹ lub poniżej tej wartości.

Ostatnią kontrolą jest próbka negatywna BrDU/PI. Należy przeprowadzić tę kontrolę negatywną, aby upewnić się, że komórki nie pojawiają się w żadnej z górnych ani prawych ćwiartek. Po ustawieniu parametrów poszczególnych wykresów cytometr przepływowy jest skalibrowany i gotowy do analizy komórek barwionych BrDU i PI. Dla każdej próbki należy zebrać dane z minimum 10 000 komórek wyselekcjonowanych za pomocą bramkowania PI.

Następnie, korzystając z oprogramowania takiego jak FlowJo lub FACSDiva, należy stworzyć wykres FITC względem PI, bramkując komórki jako PI-dodatnie na podstawie wykresu PI względem FL2, aby wyodrębnić populację komórek w cyklu. Następnie należy utworzyć drugą bramkę w celu izolacji populacji BrDU-dodatniej.

Następnie, aby prześledzić przebieg cyklu komórkowego w czasie, należy przedstawić liczbę komórek dodatnich pod kątem BRDU z zawartością DNA charakterystyczną dla fazy G1 lub G2 w funkcji czasu, aby porównać kinetykę progresji cyklu komórkowego między dwiema liniami komórkowymi raka jelita grubego HT 29 i LS 180. Komórki zbierano co godzinę przez osiem godzin po usunięciu impulsu A-B-R-D-U.

Porównując kinetykę obu profili, w komórkach LS 180 w czwartym punkcie czasowym po podaniu BRDU widoczny jest szczyt fazy G1, podczas gdy w odpowiadającym mu punkcie czasowym dla linii komórkowej HT 29 szczyt ten nie występuje. Wskazuje to na przyspieszoną progresję cyklu komórkowego przez fazę G2. W linii komórkowej raka jelita grubego LS 180, aby wygenerować profil cyklu dla linii komórkowej raka piersi.

Komórki MC seven zbierano co godzinę przez osiem godzin, po usunięciu impulsu BRDU. Następnie komórki z immunoznakowaniem i kontrastowaniem DNA sortowano na podstawie ich sygnałów fluorescencyjnych.

Jak widać, komórki CF seven cyklowały w znacznie wolniejszym tempie niż każda z dwóch badanych linii komórkowych raka jelita grubego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre zrozumienie tego, w jaki sposób znakowanie metaboliczne DNA w połączeniu z pobieraniem próbek w określonych punktach czasowych pozwala śledzić kinetykę cyklu komórkowego.