Tomografia dyfuzyjna fluorescencji w dziedzinie czasu sterowana tomografią komputerową u małych zwierząt w celu lokalizacji biomarkerów nowotworowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uzyskanie obrazów fluorescencyjnych ekspresji receptora Epidermal Growth Factor Receptor w ortotopicznym modelu mysim glejaka. Osiąga się to poprzez inokulację lewej półkuli mózgu myszy A IIC ludzkimi komórkami glejaka U2 51 wykazującymi ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego. Po dwóch tygodniach wzrostu guza mysz otrzymuje wstrzyknięty koktajl dwóch znaczników fluorescencyjnych.

Następnie mysz jest poddawana obrazowaniu w systemie rentgenowskim dla małych zwierząt w celu zebrania danych anatomicznych niezbędnych do dokładnej rekonstrukcji obrazu. Dane te są wykorzystywane do anatomicznego rozmieszczenia źródła i detektorów systemu tomografii optycznej, a dedykowane oprogramowanie służy do zbierania danych fluorescencyjnych i konstruowania obrazu końcowego. Ostatecznie metoda ta pozwala na stworzenie obrazu guza w oparciu o jego nadekspresję epidermalnego czynnika wzrostu, wykorzystując zarówno obrazowanie fluorescencyjne, jak i rentgenowskie, natomiast dokładność tej metody można porównać z rezonansem magnetycznym z użyciem środka kontrastowego.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tomografia fluorescencyjna małych zwierząt oparta na urządzeniach z wykorzystaniem sprzężonych ładunkowo urządzeń, jest to, że detekcja z zliczaniem pojedynczych fotonów przy użyciu fotopowielaczy oferuje znacznie wyższą czułość i zakres dynamiczny detekcji światła. Metoda ta może być ostatecznie wykorzystana do monitorowania i oceny skuteczności terapii molekularnych poprzez pomiar ekspresji ich celów. Podczas gdy guzy podskórne są łatwo obrazowane metodami nietomograficznymi z wykorzystaniem obrazowania powierzchniowego, system ten został zaprojektowany do obrazowania przez tkankę o grubości do kilku centymetrów, co czyni go szczególnie odpowiednim do obrazowania dostarczania środków kontrastowych i ich wycieku do guzów mózgu.

Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat ekspresji biomarkerów nowotworowych, można ją również zastosować w innych badaniach nad chorobami, takich jak infekcje, otyłość lub aspekty starzenia się, np. choroba Alzheimera. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na rozproszony charakter propagacji światła w tkance biologicznej oraz trudności w wykorzystaniu tomografii rentgenowskiej do rekonstrukcji światła rozproszonego. Kluczowe jest zatem wizualne zademonstrowanie tej metody.

Ponieważ etapy gromadzenia danych i rekonstrukcji obrazów mogą być trudne do opanowania, ważne jest zapewnienie właściwej kalibracji danych pobranych z systemu fluorescencyjnego. Pakiet oprogramowania near fast został zaprojektowany tak, aby odczytywać dane optyczne i wykorzystywać obrazy z tomografii komputerowej do tworzenia siatki elementów skończonych, która służy jako szablon przestrzenny do rekonstrukcji fluorescencji. Aby rozpocząć, umieść znieczuloną mysz naga atymiczna na sterylnej tkaninie chirurgicznej i potwierdź głębokość znieczulenia przed przejściem do oczyszczania i dezynfekcji skóry w obszarze nacięcia.

Używając Betadinu, przykryć miejsce ncięcia sterylnym obłożeniem chirurgicznym; za pomocą skalpela wykonać niewielkie nacięcie nieco na lewo od linii środkowej i 0,5 centymetra za linią wewnątrzgałkową. Oczyścić powierzchnię czaszki, usuwając wszelką tkankę łączną, aby możliwe było zidentyfikowanie punktów orientacyjnych. Po odsłonięciu czaszki użyć wiertarki wysokobiegowej ze sterylnym wiertłem o średnicy 1 milimetra, aby wywiercić otwór znajdujący się 2 milimetry na lewo od linii środkowej i 2 milimetry za bgma.

Napełnij strzykawkę Hamilton Micros z igłą 27G o tępym zakończeniu komórkami przeznaczonymi do implantacji. Następnie umieść mysz w aparacie stereotaktycznym. Po tym potwierdź głębokość znieczulenia chirurgicznego i estetycznego za pomocą ucisku palca u stopy, a następnie ponownie załóż na zwierzę sterylną chustę chirurgiczną.

Następnie zamocuj napełnioną strzykawkę w ramie stereotaktycznej. Ustaw strzykawkę nad otworem w czaszce i wprowadź końcówkę igły trzy milimetry poniżej powierzchni czaszki. Następnie wycofaj igłę o jeden milimetr, aby utworzyć kieszeń.

Kolejnym krokiem jest powolne wstrzykiwanie komórek do lewej półkuli mózgu w ciągu pięciu minut. Po zakończeniu wstrzykiwania wyciągnąć igłę i przemyć otwór Betadyną. Aby zapobiec wzrostowi komórek poza miejscem wstrzyknięcia, wyjąć mysz z ramion stereotaktycznych i wypełnić odsłonięty otwór podgrzanym woskiem kostnym.

Na koniec zamknij miejsce nacięcia za pomocą sterylnego szwu nylonowego 5-0. Umieść mysz w podgrzewanej klatce i monitoruj ją aż do pełnej rekonwalescencji. Po powrocie do sprawności wstrzyknij myszy doglebowo (IP) 130 µL buprenorfiny w dawce 0,1 mg/kg i pozwól guza rosnąć przez 14 dni przed obrazowaniem. W dniu obrazowania myszy uruchom system, aby lasery i detektory światła mogły się rozgrzać przez około 20 minut.

Aby uniknąć dryftów i wrażliwości systemu, umieść precyzyjnie wykonany dyfuzor liniowy o wymiarach 100 stopni na 4 stopnie w samym centrum gantry obrazującego, aby rozproszyć lasery wzbudzające pomiędzy kanałami detekcyjnymi systemu z równą intensywnością. Ręcznie dostosuj kąt dyfuzora, aby zmaksymalizować ilość sygnału wykrywanego przez wszystkie pięć kanałów zbierania światła. Następnie umieść filtr gęstości optycznej.

Dwa filtry gęstości neutralnej przed wszystkimi fotopowielaczami detekcji fluorescencji, nazywanymi PMT, oraz gęstości optycznej. Jeden filtr gęstości neutralnej przed całą detekcją transmitancji. PMT zbierają 100 czasowych funkcji rozmycia impulsu lub T psfs lasera, z których każda posiada jednosekundowy czas całkowania dla każdego lasera sekwencyjnie, normalizują każde TPSF względem referencji lasera, korygują dryft czasowy w referencji lasera i wyciągają średnią ze wszystkich iteracji dla każdego detektora i każdego lasera osobno.

Te średnie TPS-y są specyficzne dla detektora funkcje odpowiedzi instrumentu, wykorzystywane w optycznej rekonstrukcji obrazu na 12 godzin przed procedurą obrazowania. Wstrzyknij myszy testowej koktajl znaczników fluorescencyjnych. Najtrudniejszymi aspektami tej procedury są dokładna kalibracja systemu tomografii fluorescencyjnej oraz ograniczenie ruchów zwierzęcia.

Rekonstrukcja obrazu jest tak źle uwarunkowana, że nawet niewielkie błędy w gromadzeniu danych mogą prowadzić do istotnych błędów w zrekonstruowanym obrazie. Aby zapewnić dokładność zbieranych danych, unieruchamiamy mysz tak dobrze, jak to możliwe, i powtarzamy kalibrację przed oraz po skanowaniu, aby zwiększyć szansę na uzyskanie precyzyjnej kalibracji. Po przygotowaniu umieść znieczulone zwierzę na wspornikach z włókna szklanego stołu do obrazowania.

Po umieszczeniu głowy w stożku nosowym do ciągłej anestezji gazowej, należy unieruchomić zęby na listwie zgryzowej i przymocować zwierzę taśmą. Myszy powinny znajdować się mniej więcej w centrum gantry obrazującego. Pozycjonowanie można przeprowadzić, obracając laser wzbudzający o 180 stopni wokół myszy, upewniając się, że punkt ogniskowania lasera oświetla punkt znajdujący się mniej więcej w centrum ciała myszy z perspektywy lasera pod wszystkimi kątami.

Po prawidłowym ustawieniu ostrożnie przenieś platformę obrazującą wraz z myszą do skanera mikro-CT i zbierz informacje anatomiczne w rozdzielczości 93 micrometers izotropowo dla całej głowy myszy. Przejrzyj stos obrazów CT i wybierz przekroje do obrazowania w systemie tomografii fluorescencyjnej. Ostrożnie przenieś platformę obrazującą i mysz z powrotem do systemu tomografii fluorescencyjnej.

Wybierz liczbę pozycji źródła dla każdego przekroju obrazowania, czas całkowania dla każdego pomiaru TPSF, liczbę iteracji dla każdej pozycji źródła oraz pozycję i liczbę pożądanych przekrojów obrazowania z wcześniej utworzonego stosu obrazów CT. Następnie umieść filtry przed PMT detekcji fluorescencji, aby zablokować całe światło wzbudzenia, oraz filtry gęstości optycznej (filtry neutralne) przed PMT detekcji transmitancji. Aby uniknąć nasycenia tych detektorów, uruchom oprogramowanie do akwizycji danych, zbierając tpsf fluorescencji i transmitancji dla każdej zdefiniowanej pozycji źródło-detektor przy obu długościach fal wzbudzenia.

Dla każdego zestawu zebranych PSF-ów T monitoruj i rejestruj intensywność lasera za pomocą referencyjnego kanału PMT. Wyznacz powierzchnię zewnętrzną myszy oraz położenie podłoża do obrazowania. Wyznacz pręty wspierające z obrazów CT i stwórz maski obejmujące obszar myszy oraz pręta obrazującego.

Osobno, wykorzystując maskę myszy, wygeneruj siatkę elementów skończonych zwierzęcia za pomocą oprogramowania near fast. Zlokalizuj pozycje źródeł i detektorów z systemu tomografii fluorescencyjnej na powierzchni siatki, opierając się na współrzędnych rejestracji przestrzennej mikro-CT i fluorescencji. Usuń punkty danych optycznych powiązane z pozycjami źródeł lub detektorów, które nakładają się na miejsce położenia platformy obrazującej.

Pręty referencyjne normalizują dane zebrane dla każdej pozycji detektora źródłowego względem referencji laserowej, korygują dryft czasowy referencji laserowej oraz czułości filtrów, które zostały określone w drodze testów eksperymentalnych w momencie zakupu. Oblicz stosunek Borna dla danych z każdej pozycji detektora źródłowego i pomnóż go przez symulację modelu w przód dla transmitancji, opartą na siatce elementów skończonych zwierzęcia o jednorodnych właściwościach optycznych. Czynność tę wykonuje się w celu zminimalizowania błędów związanych z sprzężeniem źródła lub detektora z tkanką, skalibrowania danych względem modelu oraz skorygowania danych pod kątem innych aspektów niezgodności między danymi a modelem; następnie konstruuje się wektor danych składający się ze skalowanej różnicy danych stosunku Borna zebranych dla obu długości fal.

Współczynnik skalowania dobiera się tak, aby zmaksymalizować kontrast wiązania EGFR, a następnie przeprowadza rekonstrukcję obrazu w dziedzinie czasu z wykorzystaniem skalibrowanych danych różnicowych, używając TPSF dla każdego kanału detekcji jako danych wejściowych, i tworzy mapy fluorescencji widocznego znacznika celowanego z wzmocnionym kontrastem. Poniżej przedstawiono przykład rekonstrukcji fluorescencji nałożonej na zarejestrowany obraz anatomiczny CT myszy z ortotopowym glejakiem U2 51. Środek masy glejaka wyznaczony na podstawie rekonstrukcji fluorescencyjnej znajdował się w odległości jednego milimetra od środka masy guza wyznaczonego za pomocą obrazowania rezonansem magnetycznym z kontrastem.

Oprogramowanie do akwizycji danych zostało stworzone specjalnie dla tego urządzenia, jednak większość technik przetwarzania obrazów można zrealizować przy użyciu oprogramowania near fasts dostępnego pod adresem nearfasts.org. Dlatego podczas wykonywania tej procedury ważne jest upewnienie się, że zarówno system, jak i dane zostały precyzyjnie skalibrowane przed rekonstrukcją obrazu. Kalibracja ta wymaga uwzględnienia różnic w czułości i czasie odpowiedzi między detektorami po rekonstrukcji obrazu znacznika celującego w biomarker.

Podobne obrazowanie z wykorzystaniem znacznika niecelowanego umożliwia korektę w zakresie wychwytu niezależnego od receptorów. Pozwala to na ilościowe określenie ilości związanego znacznika, a także gęstości receptorów in vivo po opracowaniu tej metody. Technika ta zainspirowała innych badaczy do zaprojektowania systemów tomografii fluorescencyjnej sterowanej obrazowaniem rentgenowskim oraz utorowała drogę do obrazowania całego ciała u większych zwierząt.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś uzyskać dobre zrozumienie sposobu przeprowadzania eksperymentu z rozproszonej tomografii fluorescencyjnej, która łączy systemy obrazowania anatomicznego rentgenowskiego oraz obrazowania optycznego w celu obrazowania biomarkerów nowotworowych.