Protokoły barwienia dla ludzkich wysepek trzustkowych
23 maja 2012
W niniejszym filmie zaprezentowano procedury charakterystyki ludzkich wysepek trzustkowych z wykorzystaniem barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz immunohistochemii (IHC). Przekroje trzustki z obszarów głowy, trzonu i ogona poddaje się barwieniu H&E oraz IHC w celu określenia składu endokrynnego wysepek (insulina, glukagon i polipeptyd trzustkowy), replikacji komórek (Ki67) oraz nacieków zapalnych (H&E, CD3). Obszar haczykowaty jest lokalizowany za pomocą IHC w kierunku polipeptydu trzustkowego.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest charakterystyka ludzkich wysepek trzustkowych z wykorzystaniem barwienia hematoksyliną i eozyną oraz immunohistochemii. Osiąga się to poprzez przygotowanie seryjnych skrawków z próbki trzustki zatopionej w bloku parafinowym. Następnie skrawki są przenoszone na szkiełka w ich pierwotnej orientacji.
Część preparatów barwi się hematoksyliną i eozyną, natomiast pozostałe preparaty poddawane są barwieniu immunohistochemicznemu; ostatnim krokiem jest zeskanowanie zabarwionych preparatów i uporządkowanie ich według przypadków. Ostatecznie obrazy te mogą zostać przesłane do internetowej bazy danych patomorfologicznych, gdzie mogą być przeglądane przez innych badaczy w tej dziedzinie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że preparaty są barwione seryjnie przy zachowaniu ich pierwotnej orientacji.
Procedurę zaprezentują Linda Snyder, histotechnik, Emily Montgomery, biolog oraz Tiffany Hippo, technik laboratoryjny z mojego laboratorium. Na początek należy przygotować kąpiel wodną i mikrotom zgodnie ze standardowymi procedurami mikrotomii parafiny. Następnie należy opisać szkiełka dodatnio naładowane, podając numer przypadku, region trzustki oraz numer szkiełka.
Po przygotowaniu wszystkich elementów należy umieścić bloczek parafiny w uchwycie mikrotomu tak, aby etykieta kasety znajdowała się po lewej stronie. Zgodnie ze standardowymi procedurami mikrotomii, należy wykonywać skrawki z bloczka, aż do momentu równomiernego odsłonięcia tkanki. Po uzyskaniu jednorodnego przekroju tkanki należy wykonać serię skrawków o grubości około 4 µm.
W zależności od liczby wymaganych barwień wstępnych niezbędnych jest od trzech do sześciu skrawków. Następnie należy rozdzielić skrawki z taśmy. Należy pobrać każdy skrawek po kolei i umieścić go na szkiełku.
Zapisz numer przekroju ołówkiem. Jeśli przekrój jest niezdatny do użycia, pomiń ten numer i kontynuuj numerowanie kolejnych przekrojów w dokładnej kolejności. Należy zadbać o zachowanie na szkiełku tej samej orientacji, w jakiej znajdował się materiał w kasecie, z etykietą szkiełka skierowaną w lewo.
Następnie umieść preparaty w statywie do szkiełek i pozostaw je do wyschnięcia na noc. W temperaturze pokojowej ponownie zabezpiecz powierzchnię bloku parafinowego cienką warstwą parafiny, aby zakonserwować tkankę, a następnie zarchiwizuj go w temperaturze pokojowej lub minus 20 stopni Celsjusza. Powtórz tę procedurę dla kolejnej próbki.
Ważne jest zachowanie numeracji dla serii skrawków na każdym poziomie, zgodnie z powyższym opisem dla barwienia H&E. Pierwszy preparat z każdego bloku należy umieścić w kasecie do slajdów, a następnie włożyć kasetę do pierwszej kuwety automatycznego barwiarki. Należy wybrać standardowy program HE i rozpocząć proces barwienia.
Po zakończeniu barwienia wyjmij preparaty z automatycznego barwiarki i umieść je w dygestorium w celu nałożenia szkiełek zakrywek. Na każdy preparat nałóż szkiełko zakrywką, stosując standardowe techniki. Na koniec opisz preparaty za pomocą wydrukowanych etykiet i pozostaw je w dygestorium do całkowitego wyschnięcia.
Należy rozpocząć od skonfigurowania automatycznego barwiarki i przygotowania wszystkich niezbędnych odczynników. Do barwień podwójnych należy wybrać program Daco. Następnie należy wprowadzić liczbę preparatów oraz rodzaj obróbki, jaką otrzyma każdy z nich.
Wprowadzić wszystkie odczynniki do automatycznego barwiarki zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie przygotować bufor TBST, bufor cytrynianowy, przeciwciała oraz pozostałe odczynniki wymagane do procedury. Odparafinizować preparaty, umieszczając slajdy w ksylenie na pięć minut.
Nie należy dopuścić do wyschnięcia preparatów, ponieważ spowoduje to nadmierne barwienie tła i porów podczas deparafinowania. Przed użyciem należy wlać bufor cytrynianowy do steamera w celu wstępnego podgrzania. Następnie preparaty po deparafinowaniu należy poddać serii płukań w etanolu.
Przepłucz preparaty po raz ostatni w wodzie dejonizowanej. Przenieś preparaty do podgrzanego buforu cytrynianowego i pozostaw do inkubacji w temperaturze wrzenia przez 30 minut. Po tym czasie niezwłocznie przenieś preparaty do kąpieli wodnej o temperaturze pokojowej i pozostaw do całkowitego ochłodzenia.
Po ochłodzeniu przenieś preparaty do kaset automatycznego barwiarki Dayco, dbając o zachowanie właściwej kolejności. Na koniec uruchom wcześniej wgrany program podwójnego barwienia. Po zakończeniu programu podwójnego barwienia wyjmij preparaty z automatycznej barwiarki i pozostaw je do wyschnięcia na co najmniej jedną godzinę przed odwodnieniem.
Aby kontynuować odwadnianie, przenieś je do 80% etanolu na jedną minutę. Kontynuuj odwadnianie preparatów poprzez moczenie ich w 95% etanolu, a następnie w 100% etanolu. Na koniec zanurz preparaty w ksylenie i potrzymaj je w nim przez jedną minutę.
Aby zakończyć procedurę, bezzwłocznie zamocuj szkiełka podstawowe za pomocą szkiełek nakrywkowych, używając preparatu cyto seal. Wydrukuj etykiety zawierające informacje o przypadku, w tym narząd i numer bloku, rodzaj barwienia oraz datę. Naklej etykietę na każdym szkiełku, aby umożliwić skanowanie preparatów barwionych.
Umieść je na tacy skanera i postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami. Zarchiwizuj barwione preparaty w temperaturze pokojowej, a wszelkie pozostałe niebarwione preparaty w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. Na koniec uporządkuj obrazy barwionych preparatów według dawcy i rodzaju zaobserwowanej tkanki.
Oto przykład barwienia na KI 67 oraz insulinę przy małym i dużym powiększeniu. Obrazy zabarwionych przekrojów trzustki są przesyłane do internetowej bazy danych patomorfologicznych, tworząc wirtualną biobankę. Korzystając z tej bazy, badacze mogą szybko uzyskać informacje niezbędne do prowadzenia badań nad cukrzycą typu 1.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przygotować i barwić wysokiej jakości preparaty z ludzkiej trzustki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W tym filmie zaprezentowano procedury charakterystyki ludzkich wysepek trzustkowych z wykorzystaniem barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz immunohistochemii (IHC). Technika ta pozwala na ocenę składu endokrynnego wysepek, replikacji komórek oraz nacieków zapalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Endokrynologia
- Histologia
Wstęp
- Ludzkie wysepki trzustkowe odgrywają kluczową rolę w metabolizmie glukozy.
- Charakterystyka składu wysepek jest niezbędna dla zrozumienia cukrzycy.
- Barwienie H&E oraz IHC to standardowe techniki analizy tkankowej.
- Zachowanie pierwotnej orientacji preparatów jest krytyczne dla dokładnej oceny.
Cel badania
- Charakterystyka ludzkich wysepek trzustkowych.
- Określenie składu endokrynnego wysepek.
- Ocena replikacji komórek i odpowiedzi zapalnych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie seryjnych skrawków z próbek trzustki zatopionych w parafinie.
- Barwienie skrawków metodą H&E oraz IHC.
- Skanowanie zabarwionych preparatów do analizy.
- Organizacja obrazów według przypadków w celu przesłania do bazy danych.
Główne wyniki
- Identyfikacja insuliny, glukagonu i polipeptydu trzustkowego w wysepkach.
- Ocena replikacji komórek za pomocą barwienia Ki67.
- Ocena nacieków zapalnych poprzez barwienie H&E oraz CD3.
- Skuteczna lokalizacja obszaru haczykowatego za pomocą IHC.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia kompleksową charakterystykę wysepek trzustkowych.
- Zachowanie pierwotnej orientacji preparatu zwiększa dokładność analizy.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia funkcji trzustki w stanie zdrowia i choroby.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ustandaryzowane procedury histopatologiczne dla ludzkich wysepek trzustkowych umożliwiają powtarzalną charakterystykę komórek endokrynnych, wspierając walidację celów w badaniach nad cukrzycą. Poprzez zachowanie orientacji serii cięć oraz generowanie zdigitalizowanych obrazów całych preparatów, metoda ta ułatwia interdyscyplinarne udostępnianie danych i biobanking w celu zmniejszenia ryzyka mechanistycznego terapii skierowanych przeciwko wysepkom. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych, dostarczając mierzalnych, rozdzielczych przestrzennie danych na temat składu wysepek, replikacji oraz nacieków immunologicznych.
Strategiczne Zastosowania w Badań i Rozwoju Biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez rygorystyczną histopatologię i immunolokalizację endokrynnych komórek wysepek.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez charakteryzację morfologii, wielkości, gęstości wysepek oraz składu komórek endokrynnych z wykorzystaniem barwień H&E i IHC.
- Wartość prognostyczna: Pomaga w selekcji projektów z portfela poprzez ocenę replikacji wysepek i komórek apoptotycznych za pomocą Ki67 oraz innych markerów proliferacji.
Przesiew oraz opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych analiz poprzez standaryzowane przetwarzanie trzustki ludzkiej w celu wyodrębnienia określonych regionów (głowicy, trzonu, ogona) oraz wykonania przekrojów poprzecznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji i powtarzalności testów poprzez numerowanie i oznaczanie literowe podsekcji w zależności od ich rozmiaru, co umożliwia pełną analizę przekrojów poprzecznych.
- Wartość platformy: Wykazanie gotowości do badań przesiewowych i skalowalności dzięki zdigitalizowanym obrazom całych preparatów, zorganizowanym w internetowej bazie danych patomorfologicznych, dostępnej dla ponad 200 badaczy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omówienie znaczenia dla choroby poprzez ocenę stanu zapalnego, włóknienia, obecności amyloidu oraz nacieków limfocytów T w wyzyskach trzustkowych z wykorzystaniem barwień H&E oraz CD3.
- Wartość operacyjna: Opis ciągłości procesu od etapu odkryć po walidację przedkliniczną poprzez ocenę zarówno części endokrynnej, jak i egzokrynnej, w tym patologii cewek oraz neoplazji.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Koncentracja na predykcyjnej redukcji ryzyka poprzez charakterystykę wewnątrzprzewodowej neoplazji trzustki oraz jej związku z układem przewodowym.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania – od wczesnej walidacji celu po ocenę przedkliniczną – umożliwiając seryjne cięcie, standaryzowane barwienie oraz cyfrowe biobankowanie ludzkiej tkanki trzustki.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez histopatologię oraz immunolokalizację wysepek trzustkowych i komórek endokrynnych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość i powtarzalność analizy poprzez zachowanie pierwotnej orientacji preparatów podczas seryjnego cięcia i barwienia seryjnego.
- Analityka: Podkreśla pomiary ilościowe powierzchni wysepek, ich liczby, składu komórek endokrynnych, replikacji oraz nacieków limfocytów T za pomocą barwienia H&E i IHC, co umożliwia porównanie między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez ocenę amyloidu w wysepkach, włóknienia oraz nacieków zapalnych istotnych dla patogenezy cukrzycy typu 1.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako powtarzalną funkcjonalność dzięki internetowej bazie danych patologicznych, która zapewnia szybkie udostępnianie danych i wybór bloków dla seryjnych skrawków parafiniowych lub mrożonych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w składzie endokrynnym wysepek oraz w interakcjach immunologicznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność seryjnego cięcia, barwienia oraz cyfrowej archiwizacji preparatów.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zmniejszone ryzyko biologiczne w późnych etapach dzięki wczesnej identyfikacji patologii wysepek i statusu replikacji.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje dotyczące dalszego rozwoju w oparciu o mierzalną morfologię wysepek, ich gęstość oraz fenotypy komórek endokrynnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna z zakresu histotechnologii, immunohistochemii oraz cyfrowych procesów patomorfologicznych.
- Potrzeby w zakresie instrumentarium i infrastruktury analitycznej, w tym mikrotom, automatyczny barwiarka, skaner slajdów oraz dostęp do internetowej bazy danych patomorfologicznych.
- Wymogi standaryzacji międzyzespołowej w zakresie etykietowania slajdów, numeracji przekrojów oraz zachowania orientacji tkanek pomiędzy zespołami histologicznymi i obrazowymi.
- Kwestie adaptacyjne w odniesieniu do różnych systemów modelowych, w szczególności w przypadku stosowania standaryzowanego przetwarzania regionalnego (głowa, trzon, ogon) w odniesieniu do trzustek nie-ludzkich.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność tkanek pochodzących od dawców narządów oraz konieczność zoptymalizowanej walidacji przeciwciał dla multipleksowego barwienia IHC.
