Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą Miltenyi MACS

To jest magnes Max MIDI. Widnieje na nim ostrzeżenie: uwaga, ekstremalnie silne pola magnetyczne. Cześć, nazywam się Melanie Matthew i pochodzę z laboratorium Mike'a Collinsa z Katedry Fizjologii i Biofizyki Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine.

Dzisiaj zaprezentujemy przygotowanie komórek T CD4+ za pomocą selekcji negatywnej z wykorzystaniem zestawów Milton Biotechnology. Mamy tutaj systemy MiniMax oraz MidiMax; magnesy MiniMax są stosowane do rozdzielania większych ilości materiału. Przez kolumnę pasującą do MiniMax można przepuścić do 10⁹ komórek, natomiast MidiMax służy do pracy z znacznie mniejszymi objętościami komórek.

W zależności od tego, czy przeprowadzana jest separacja pozytywna czy negatywna, komórki należy znakować odpowiednim przeciwciałem. Są one sprzężone z koralikiem magnetycznym, który przyczepi się do magnesu. W przypadku selekcji negatywnej komórki, które są przedmiotem zainteresowania, przejdą przez kolumnę, a następnie można zebrać eluat, który będzie zawierał poszukiwane komórki.

Powinienem wspomnieć, że techniki, które prezentuję dzisiejszego wieczoru, nie są sterylne. Dlatego, jeśli chcą Państwo wykorzystać te komórki do hodowli komórkowej, należy wszystko przeprowadzić w dygestorium do hodowli tkanek, używając sterylnych narzędzi. Zatem, mimo że prezentuję przygotowanie dla limfocytów T CD4+, wiele z tych technik ma zastosowanie przy oczyszczaniu innych typów komórek z wykorzystaniem zestawów Miltenyi Biotec.

Dobrze, usunęłam węzły chłonne z myszy; szczegółowy sposób postępowania w tym zakresie przedstawiam w siódmym wydaniu JoVE: przygotowanie węzłów chłonnych do obrazowania dwufotonowego. Teraz rozdrobię węzły chłonne do postaci zawiesiny pojedynczych komórek wewnątrz sitka komórkowego o oczkach 70 µm. Dobrze, teraz rozdrobię węzły chłonne do zawiesiny pojedynczych komórek, używając tłoka strzykawki o pojemności 6 mL.

Węzły chłonne znajdują się w medium RPMI wewnątrz filtra; ważne jest, aby przygotować prawidłową zawiesinę pojedynczych komórek. Używamy filtra, aby mieć pewność, że w próbce nie ma aglomeratów komórkowych. Po zakończeniu rozcierania wyjmę filtr z medium, a następnie wykorzystam materiał, który przeszedł przez sito, tworząc zawiesinę pojedynczych komórek.

Podczas rozcierania należy upewnić się, że tkanka została rozbita w możliwie największym stopniu. Z tej zawiesiny pojedynczych komórek będziemy oczyszczać limfocyty T CD4+. Dobrze, rozcieranie tkanki zostało zakończone i widać, że większość węzłów chłonnych została całkowicie rozdrobniona.

Pozostały nam tutaj niewielkie fragmenty tłuszczu oraz rodzaj otoczki węzła chłonnego z niewielką ilością tkanki łącznej, które posklejały się z wszystkich sześciu węzłów chłonnych. Teraz usuwam sitko do komórek. Widać tutaj, że medium jest bardzo mętne.

Jest ona wypełniona zawiesiną pojedynczych komórek, aby zapewnić uzyskanie maksymalnej liczby komórek z filtra, gdyż część z nich może się do niego przykleić. Przemywam ją kilkoma ml pożywki, a następnie pipetuję całą pożywkę do probówki Falcon 15 ml i wiruję, aby uzyskać osad komórek do późniejszej puryfikacji. Oto moja zawiesina pojedynczych komórek, odwirowana i osadzona przy 300 G przez 10 minut.

Jeśli przypuszczają Państwo, że w zawiesinie pojedynczych komórek pojawi się duża populacja martwych komórek, warto zastosować zestaw do usuwania martwych komórek firmy Miltenyi Biotec. Po odwirowaniu osadu zlewam pożywkę i przeprowadzam lizę erytrocytów, a następnie policzę komórki i zastosuję zestaw do negatywnej selekcji limfocytów T CD4+ w odniesieniu do tych konkretnych komórek. Dobrze, teraz przystępuję do lizy RBC.

Przeprowadzimy lizę erytrocytów, które zostały odwirowane wraz z limfocytami, poprzez obniżenie osmolarności roztworu – najpierw dodając wodę, a następnie przywracając stężenie do roztworu 1x poprzez dodanie 10x DPBS. Limfocyty są bardziej odporne na zmiany osmolarności niż erytrocyty, jednak nadal musimy pracować szybko, aby nie doprowadzić do lizy limfocytów, czego chcemy uniknąć. Elementem szybkiego działania jest przygotowanie odpowiednich objętości odczynników potrzebnych do lizy jeszcze przed dodaniem wody do układu.

Chcę móc dodać mój 10 X-D-B-P-S kilka sekund po dodaniu wody, aby upewnić się, że nie dojdzie do lizy limfocytów, a jedynie do lizy erytrocytów. Pobieram więc 900 µL wody – to prawie jeden mililitr – oraz 100 µL 10 X-D-B-P-S.

Przygotowałem obie probówki. Do buforu do lizy dodaję wodę, czekam kilka sekund, być może lekko wstrząsam probówką, a następnie dodaję 10 X-D-B-P-S i ponownie lekko wstrząsam probówkę. Jeśli lizujesz dużą ilość erytrocytów, zauważysz powstanie dużej, amorficznej masy składającej się z rozbitych błon komórkowych.

Mamy tutaj niewielką ilość materiału i można zauważyć, że są to w niewielkiej mierze uszkodzone błony komórkowe. Zatem po przeprowadzeniu lizy, na wypadek ewentualnych błędów podczas pipetowania, zazwyczaj dodaję do komórek kilka ml pożywki, aby upewnić się, że osmolarność jest prawidłowa i aby nie doprowadzić do dalszej lizy. Dobrze, teraz mam limfocyty w zawiesinie pojedynczych komórek.

Ponownie, po przeprowadzeniu lizy erytrocytów, odwiruję komórki w celu ich osadzenia. Przed tym etapem policzę je za pomocą komory licznikowej (hemocytometru), aby określić ilość przeciwciał niezbędną do zastosowania zestawu do selekcji negatywnej komórek T CD4+. Teraz odwiruję komórki w buforze MACS; można zauważyć, że po przeprowadzeniu lizy erytrocytów osad jest znacznie bielszy.

Następnie przeprowadzę selekcję negatywną w celu wyizolowania limfocytów T CD4+. Odleję całą pożywkę oraz bufor MACS, w którym wirowano komórki. Następnie przeprowadzę znakowanie przy użyciu koktajlu przeciwciał biotynylowanych, co stanowi pierwszy krok w selekcji negatywnej limfocytów T CD4+.

Następnie inkubuję w lodówce przez 10 minut. Dobrze, wstępna inkubacja komórek została zakończona. Teraz dodam antybiotyk do mikrokulek i ponownie umieszczę je w lodówce na 15 minut.

W przypadku tej konkretnej separacji komórek używamy kolumny LS firmy Miltenyi Biotech. Umieścimy ją na uchwycie magnetycznym i przygotujemy kolumnę, przepuszczając przez nią 3 mL buforu MACS. Otworzymy kolumnę i umieścimy ją tak, aby wypustki były skierowane do wnętrza magnesu. Teraz dodam bufor MACS do kolumny; należy zauważyć, że przemieszcza się on w dół kolumny LS i zaczyna wyciekać u dołu. Nie należy obawiać się całkowitego wyschnięcia kolumny.

Napięcie powierzchniowe cieczy zapobiegnie jej całkowitemu wyschnięciu do momentu dodania komórek. Przed dodaniem komórek ważne jest, aby bufor Max został całkowicie wchłonięty przez kolumnę. Zatem po 15-minutowej inkubacji z naszymi magnetycznymi kuleczkami biotynowymi, które naniesiono na komórki w buforze Max, odleję bufor i ponownie zawieszę komórki w ilości buforu odpowiedniej dla liczby komórek.

W związku z tym należy sprawdzić protokół dla zestawu Mini, aby go zweryfikować. Następnie naniosę je na kolumnę, którą przed chwilą przelaliśmy buforem MAX. Teraz dodamy zawiesinę komórkową do kolumny.

Ponieważ jest to kolumna do selekcji negatywnej, zbierzemy komórki, które przepłynęły przez kolumnę, a w tym przypadku powinny to być wszystkie limfocyty T CD4+. Teraz przemyję kolumnę 12 ml buforu MAC, ponownie zbierając eluat, który powinien zawierać wyłącznie limfocyty T CD4+. Następnie odwiruję limfocyty T CD4+, resuspenduję je, a potem oznaczuję odpowiednim barwnikiem, którego będę używać do obrazowania białka tau.

Pobiorę również niewielką próbkę oczyszczonych komórek, oznaczę je przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD4, a następnie poddam analizie FACS, aby upewnić się, że otrzymałem czystą populację limfocytów T CD4-dodatnich. Oto widok komórek, które właśnie odwirowaliśmy. Powinna to być populacja czystych limfocytów T CD3- i CD4-dodatnich.

Właśnie zaprezentowałem proces selekcji negatywnej dla limfocytów T CD4+. Używając zestawu firmy Miltenyi Biotec, dokonamy adoptywnego transferu tych komórek do myszy, którą wykorzystamy w jednym z naszych własnych eksperymentów T-cell photon machine. Powodzenia w Państwa własnych badaniach.