Interferencja RNA oparta na wektorach DNA w badaniu funkcji genów w nowotworach

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie funkcji genów przy użyciu interferencji RNA opartej na wektorach DNA. Zostaje to osiągnięte poprzez zaprojektowanie i wygenerowanie konstruktów shRNA celujących w konkretne geny, a w drugim kroku poprzez wytworzenie lentiwirusa niosącego kasetę ekspresyjną shRNA.

Następnie tworzy się stabilne linie komórkowe poprzez zakażenie komórek lentiwirusem, a komórki zakażone lentiwirusem wykorzystuje się w różnych testach in vitro i in vivo, aby określić efekty wyciszenia badanego genu. Ostatecznie, w zależności od zastosowanych testów, wyniki mogą wykazać zmiany w geniczności nowotworowej komórek w wyniku knockdownu genu, co potwierdzają testy proliferacji, migracji i inwazji in vitro, a także modele tworzenia ksenograftów in vivo. Procedurę zaprezentują Daniel Stowell oraz Ma Juan; Daniel jest studentem studiów doktoranckich w moim laboratorium, a Ma jest technikiem.

Chang jest pracownikiem naukowym na stażu podoktorskim. Ta metoda może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem, takie jak to, czy konkretny gen odgrywa rolę w rozwoju i progresji nowotworu oraz dla których aspektów tych procesów może być on istotny. Aby rozpocząć, należy zaprojektować i zamówić oligonukleotydy zgodnie z opisanymi kryteriami; Anil przygotował dwa rewersyjnie komplementarne oligonukleotydy zawierające docelową sekwencję od 20 do 23 nukleotydów w genie docelowym.

Na obu końcach utworzą one miejsca Eco R I oraz Hind III. Po wyżarzaniu kolejny oligonukleotyd, zawierający sekwencję odwrotnie komplementarną do sekwencji docelowej, przyłącza się swoim końcem 3' do końca 3' promotora H1 lub U6 za pomocą startera upstream.

Wykonaj reakcję PCR w celu otrzymania fragmentu posiadającego miejsca rozpoznawane przez enzymy BamHI oraz HindIII na obu końcach. Równocześnie przeprowadź trawienie wektora lentiwirusowego oraz fragmentu PCR. Następnie przeprowadź reakcję ligacji trzech fragmentów: wektora, fragmentu PCR oraz oligonukleotydów Anil.

Przy stosunku molarnym 1:10:10 otrzymany wektor będzie produkował interesujące nas hRNA z sekwencją Hindi III w regionie pętli. W przypadku użycia wektora indukowalnego produkcja hRNA będzie zależeć od obecności cząsteczki induktora, takiej jak doksycyklina w systemie Tet on. Następnie należy przeprowadzić transformację wysoko wydajnych, kompetentnych komórek e coli DH5α za pomocą produktu ligacji i zidentyfikować pozytywne wektory, stosując przesiewową metodę PCR w koloniach.

Przeprowadź amplifikację produktu obejmującego wektor oraz miejsce ligacji indukowalnego promotora. Wyizoluj plazmidowe DNA z dodatnich kolonii za pomocą komercyjnego zestawu. Następnie potwierdź obecność wstawki poprzez trawienie enzymami BamH I i EcoR I oraz za pomocą elektroforezy DNA w żelu agarozowym.

Dodatkowo należy przeprowadzić sekwencjonowanie regionu zawierającego promotor i S-H-R-N-A przy użyciu LIGA nucleotide P five. Wykorzystując zestaw do MIDI lub maxi prep wolny od endotoksyn, należy przygotować DNA lentiwirusa zawierające kasetę ekspresyjną HRNA. Stężenie DNA należy określić poprzez pomiar absorbancji przy 260 nanometrach, a czystość DNA potwierdzić, sprawdzając, czy stosunek absorbancji przy 260 do 280 nanometrach mieści się w przedziale od 1,8 do 2,0.

Na koniec przeprowadź elektroforezę plazmidu lentiwirusowego na żelu agarozowym, aby upewnić się, że posiada on formę superzwiniętą. Przed transfekcją przygotuj odpowiednie roztwory, powoli dodając 0,9 ml roztworu A do 0,9 ml roztworu B, jednocześnie napowietrzając roztwór B za pomocą pipety. Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W kolejnym kroku powoli nanieś 0,6 ml mieszaniny na trzy różne płytki 10 cm z komórkami HEK 293 T.

Następnie, po upływie od czterech do sześciu godzin, przenieś komórki z powrotem do inkubatora. Wymień pożywkę na 7 ml pełnej pożywki DMEM. Po 24 godzinach dodaj kolejne 5 ml pożywki, a po kolejnych 24 godzinach zbierz pożywkę zawierającą lentiwirusa.

Wiruj zebrany medium z prędkością 1500 RPM w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przefiltruj nadsącz za pomocą filtra 0,45 mikrometra. Wiruj przefiltrowane medium zawierające lentiwirusa w ultrawirówce.

Zlejcie supernatant do pojemnika na odpady zawierającego 5% wybielacza. Resuspendujcie osad z lentiwirusa w ilości od 0,5 do 1 ml zimnego 1x PBS. Następnie podzielcie roztwór lentiwirusa na alikwoty o objętości od 50 do 100 µL w celu przechowywania w temperaturze -80 °C.

Na koniec należy określić miano lentiwirusa za pomocą wiarygodnej techniki. Zazwyczaj naczynie hodowlane o średnicy 10 centymetrów pozwala uzyskać od 50 do 100 milionów jednostek zakaźnych przed przystąpieniem do infekcji komórek. W tej procedurze należy wyznaczyć MOI miana lentiwirusa, wykorzystując odpowiedni zestaw lub metodę R-T-P-C-R.

Zaleca się stosowanie MOI niższego niż cztery. Należy rozpocząć od wysiania komórek przeznaczonych do infekcji na płytkę sześciodołkową do uzyskania 30 do 40% konfluencji i inkubowania ich przez noc. Następnego dnia.

Wymień pożywkę na 1 ml świeżej pożywki zawierającej polybrain lub protaminę. Następnie dodaj od 1 do 2 milionów j.m. lentiwirusa zawierającego marker fluorescencyjny lub antybiotykowy.

Powoli potrząsaj płytką przez 10 sekund w celu wymieszania i inkubuj ją przez sześć godzin. Po sześciu godzinach wymień pożywkę na zwykłą, kompletną pożywkę i propaguj komórki przez dwa dni. Po dwóch dniach pożywki nie powinny zawierać antybiotyków ani induktorów, niezależnie od zastosowanego lentiwirusa.

Jeśli lentiwirus zawiera marker antybiotykowy, należy dodać odpowiedni antybiotyk. Podobnie, w przypadku lentiwirusów indukowalnych, należy dodać induktor do połowy kultur. Po hodowli komórek przez kolejne dwa lub trzy dni z antybiotykami i induktorami, należy przeprowadzić analizę Western blot w celu sprawdzenia wyciszenia docelowego genu przed przygotowaniem ksenoprzeszczepów za pomocą trypsyny.

Zebrać komórki z dużych naczyń hodowlanych i zawiesić je w oryginalnym medium zawierającym 50% matrigelu. Niezbędne jest utrzymywanie zawiesiny komórek nowotworowych w 50% matrigelu oraz strzykawki w lodzie. W przeciwnym razie istnieje ryzyko, że matrigel stwardnieje i proces zostanie przerwany.

Przygotować miejsce operacyjne, dokładnie oczyszczając je 70% ethanol i przeprowadzić znieczulenie przy zapewnieniu doskonałej wentylacji oraz z filtrem pochłaniającym isoflurane przymocowanym do komory indukcyjnej. Znieczulić myszy nago z deficytem grasicy, stosując 2% isoflurane zmieszany z 1,5% oxygen na trzy do pięciu minut przed inokulacją komórek. Następnie podtrzymywać znieczulenie, podając 2% isoflurane zmieszany z oxygen za pomocą maski nosowej.

Umieść mysz na podkładce grzewczej ustawionej na 30 °C. Przenieś komórki do strzykawek z igłami o rozmiarze 25,5 G do zastrzyków podskórnych lub igłami o rozmiarze 28–30 G do zastrzyków ortotopowych. Pięć minut po indukcji znieczulenia, w jednym lub dwóch miejscach, wstrzyknij od 1 do 10 milionów komórek w bolusach o objętości 200 µL.

Liczba komórek zależy od złośliwości lub agresywności komórek nowotworowych. W przypadku wektorów konstytutywnie aktywnych należy wykorzystać dwie grupy myszy, którym wstrzyknięto komórki wykazujące ekspresję albo genu docelowego S-H-R-N-A, albo wektorów z sekwencją S-H-R-N-A typu scrambled. Te same dwie grupy należy podzielić na podgrupy, którym podawano lub nie podawano induktora w wodzie do picia.

Wymieniaj wodę w poidłach dwa razy w tygodniu. Monitoruj objętość guzów co tydzień lub co dwa tygodnie za pomocą suwmiarki. Upewnij się, że objętość guza nie przekracza limitów instytucjonalnych lub ACUC i uśmierć wszystkie zwierzęta wykazujące rozległe owrzodzenie, martwicę, wyraźną infekcję, niekontrolowany krwotok lub chorobę w stadium końcowym. Aby monitorować wzrost guza i przerzuty za pomocą markera bioluminescencyjnego, zdezynfekuj obszar roboczy i znieczul myszy w komorze obrazującej za pomocą znieczulenia gazowego.

Najpierw wykonaj ekspozycję od dwóch do pięciu minut, sprawdź intensywność sygnału, a następnie odpowiednio ją dostosuj. Jeśli rozmiar guza przekracza 1000 mm³ lub instytucjonalny limit wielkości, uśmierć zwierzę podczas poświęcenia, udokumentuj rozmiar guza i zachowaj go do dalszej analizy. Niniejszy protokół został zastosowany w celu zbadania wpływu wyciszenia genu why Y one na tworzenie ksenoprzeszczepów guzów z ludzkich komórek gruczolakoraka piersi wykazujących ekspresję lucyferazy, zaimplantowanych u myszy nude athymic.

Przetestowano sekwencję docelową S-H-R-N-A dla ludzkiego YY1 oraz kontrolne, przetasowane S-H-R-N-A, które nie wykazywało istotnego podobieństwa do żadnego znanego ludzkiego transkryptu. W wyniku tego skonstruowano dwa wektory lentiwirusowe, które posłużyły do wytworzenia dwóch lentiwirusów. Oba zostały wykorzystane do zainfekowania dwóch różnych populacji komórek, w wyniku czego uzyskano poliklonalne populacje komórek.

Po selekcji puromycyną analiza Western blot potwierdziła wywołany przez DS knockdown YY1 w tych zainfekowanych liniach komórkowych. Następnie wykorzystano poliklonalną populację komórek klonu trzeciego, która została zainfekowana indukowalnym shRNA przeciwko YY1 oraz kontrolnym shRNA.

Do zbadania wpływu wyciszenia YY1 na inwazję wykorzystano LENTIWIRUSY. Zaobserwowano, że wyciszenie YY1 zmniejszyło inwazyjność komórek. Analiza Western blot potwierdziła indukowane wyciszenie YY1 w komórkach z indukowanym shRNA przeciwko YY1, podczas gdy komórki zawierające kontrolę.

S-H-R-N-A nie wykazało tego efektu. Komórki te zostały następnie wykorzystane w badaniu na modelu mysim ksenoprzeszczepu w porównaniu z grupami kontrolnymi indu, YY one; myszy z implantowanymi komórkami S-H-R-N-A podawano wodę, co zgodnie z oczekiwaniami doprowadziło do istotnego zmniejszenia tworzenia się guzów, co wykazano w obrazowaniu bioluminescencyjnym oraz poprzez pomiar masy guzów. Wyciszenie YY one w tych ksenoprzeszczepach guzów zostało następnie potwierdzone za pomocą analizy western blot.

Badania Nie należy zapominać, że praca z lentiwirusami może być niezwykle niebezpieczna zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa NIH dotyczącymi badań z wektorami lentiwirusowymi; we wszystkich warunkach laboratoryjnych wymagane jest zastosowanie procedur ograniczania zagrożeń na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.