Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Celem niniejszego filmu jest opis procedury charakterystyki przejścia przepuszczalności mitochondrialnej. Słabe otwieranie w mitochondriach wyizolowanych z serca myszy. W pierwszej kolejności mitochondria są izolowane z serc myszy.

Przy użyciu metody wirowania różnicowego oceniono jakość wyizolowanych mitochondriów, wykorzystując elektrodę tlenową typu oxy thermal podłączoną do komputera w celu pomiaru wskaźnika kontroli oddychania oraz oceny integralności błony mitochondrialnej. Następnie, z wykorzystaniem aparatury spektrofluorometrycznej, przeprowadzono jednoczesny pomiar gospodarki wapniowej, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów w celu określenia przejścia przepuszczalności (pore opening).

Otrzymane dane wykazały różnice w zdolności do zatrzymywania wapnia oraz w mitochondrialnym przejściu przepuszczalności. Niska wrażliwość izolowanych mitochondriów oraz otwarcie porów mitochondrialnego przejścia przepuszczalności to złożone zjawiska, które obejmują zmiany na kilku poziomach fizjologii i anatomii mitochondriów.

Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest fakt, że jednoczesny pomiar wielu parametrów daje bardziej kompleksowy obraz zjawiska niż pomiar poszczególnych parametrów z osobna, takich jak wapń, mobilizacja czy pęcznienie. Przed rozpoczęciem procedury rozmrozić bufor do izolacji mitochondriów i sprawdzić pH, które powinno wynosić 7.4. Następnie wszystkie używane bufory, szalki i probówki umieścić w lodzie. Należy pamiętać, że wszystkie etapy protokołu izolacji mitochondriów muszą być wykonywane w lodzie.

Umieść serca z uśpionych myszy na szalce Petriego i wypłucz krew, używając zimnego buforu do izolacji mitochondriów. Następnie przenieś serca na nową szalkę Petriego za pomocą ostrza, usuń tkankę tłuszczową oraz przedsionki, a następnie posiekaj serca, aż do uzyskania homogenicznego produktu.

Przenieś posiekane serca do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj 10 mililitrów buforu do izolacji mitochondriów z dodatkiem 0,1 miligrama na mililitr trypsyny i pozostaw próbkę do trawienia na lodzie przez 10 minut. Należy pamiętać, że zastosowanie trypsyny zwiększa wydajność izolacji mitochondriów i powinno być zachowane w sposób spójny pomiędzy poszczególnymi preparacjami mitochondrialnymi.

Zalecamy jednak sprawdzenie funkcjonalności wyizolowanych mitochondriów na preparatach otrzymanych bez użycia trypsyny, aby upewnić się, że enzym nie wpływa na ich jony. Po inkubacji dodać 10 mililitrów buforu do izolacji mitochondriów zawierającego 0,1% bezkwasów tłuszczowych, BS, a oraz pięć miligramów inhibitora trypsyny i wymieszać, kilkukrotnie odwracając probówkę. Aby zneutralizować trypsynę, odzyskać trawioną tkankę poprzez wirowanie z niską lub średnią prędkością przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsiuszów.

Po wirowaniu resuspensuj tkankę w ośmiu mililitrach buforu do izolacji mitochondriów z 0,1% BSA wolnego od kwasów tłuszczowych, utrzymując próbkę na lodzie. Użyj zmotoryzowanego homogenizatora Dounce z teflonowym tłokiem, aby zhomogenizować próbkę, wykonując od czterech do sześciu przejść przy prędkości od 1 200 do 1 400 RPM. Przenieś homogenizat do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i wiruj przy 800 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

W celu osadzenia jąder komórkowych i resztek tkankowych. Po wirowaniu zebrać nadsącz zawierający mitochondria do probówek do mikrocentryfugi i wirować je przy 8,000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu na wierzchu osadu pojawi się biała warstwa.

Używając systemu próżniowego, ostrożnie odessaj i usuń białą warstwę znajdującą się nad osadem mitochondrialnym. Następnie resuspenduj pozostały ciemniejszy osad zawierający mitochondria w 1 ml buforu do izolacji mitochondriów.

Następnie odwiruj mitochondria przy 8 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odlej nadsącz i resuspenduj osad mitochondrialny. Przechowuj mitochondria w lodzie w 150 µL buforu do izolacji mitochondriów.

Oddychanie izolowanych mitochondriów mierzy się za pomocą termicznego elektrody tlenowej podłączonej do komputera i sterowanej przez oprogramowanie oxy. The plus. Elektrodę tlenową należy skalibrować w dniu przeprowadzenia eksperymentu. Do komory oxy należy dodać 2 mL buforu do oddychania mitochondriów zawierającego końcowe stężenie 1 µM rotenonu, szczelnie zamknąć komorę i rozpocząć rejestrację sygnału tlenowego.

Sygnał rejestrowany przez system i wyświetlany na ekranie komputera jest proporcjonalny do stężenia tlenu w komorze oxy therm. Po ustabilizowaniu się sygnału tlenowego należy dodać 250 µg mitochondriów i rejestrować oddychanie podstawowe przez jedną minutę. Oddychanie w tym punkcie powinno być bardzo niskie, ponieważ mitochondria oddychają na substratach endogennych.

Jest to oddychanie w stanie one. Należy dodać bursztynian do stężenia końcowego 5 mM, aby zainicjować oddychanie mitochondrialne w kompleksie II, a następnie rejestrować sygnał przez jedną minutę. Zużycie tlenu powinno wzrosnąć podczas oddychania w stanie dwa.

Aby wywołać oddychanie w stanie 3, należy dodać DP do stężenia końcowego 150 micromolar. W tym momencie zużycie tlenu powinno wzrosnąć w wyniku syntezy TP poprzez fosforylację oksydacyjną. Należy rejestrować sygnał do czasu spowolnienia oddychania, co wskazuje na zużycie DP i przejście do zapisu oddychania w stanie 4.

Stan czwarty, oddychanie przez co najmniej jedną minutę. Dodać CCCP do stężenia końcowego 1 µM i rejestrować sygnał przez jedną minutę. W tym punkcie oddychanie odsprzężone powinno być maksymalne.

Oblicz współczynnik kontroli oddychania (RCR), dzieląc szybkość zużycia tlenu podczas oddychania w stanie trzy przez szybkość zużycia tlenu podczas oddychania w stanie cztery; docelowy RCR powinien być większy niż cztery. Następnie, aby ocenić integralność błony mitochondrialnej, indukuj oddychanie w stanie trzy w nowej próbce mitochondriów, dodając DP do stężenia końcowego 1 mM.

Następnie należy zarejestrować zużycie tlenu przez jedną minutę, dodać 10 µM cytochromu C i rejestrować zużycie tlenu przez dwie do trzech minut. Ponieważ cytochrom C nie przenika przez nienaruszone błony mitochondrialne w dobrze przygotowanej preparacji mitochondriów, nie nastąpi wzrost lub nastąpi bardzo niewielki wzrost oddychania. Wzrost oddychania wskazuje na przerwanie lub uszkodzenie błon mitochondrialnych.

Instrumentacja do wieloparametrowego pomiaru otwierania poru przejścia przepuszczalności mitochondrialnej składa się z dualnego spektrofluorymetru emisyjnego Quantum Master, sterowanego komputerowo za pomocą programu Felix GX. Korzystając z programu Felix GX, należy utworzyć protokół akwizycji wielowymiarowej i wprowadzić parametry pomiaru potencjału błony mitochondrialnej oraz obrzęku dla barwników ratiometrycznych Forer i JC-1; należy wygenerować pochodne ślady dla stosunku Forer oraz stosunku JC-1 w jednorazowej czterostronnej płytce z meth ACRL; zmieszać 1 ml buforu do analizy mitochondriów z końcową koncentracją 1 µM rotenonu, 5 mM bursztynianu i 800 nM. Dla próbki FF dodać 250 µg mitochondriów i umieścić próbkę w komorze pomiarowej spektrofluorymetru.

Rozpocznij rejestrację sygnałów fluorescencji po jednej minucie, wstrzymaj akwizycję, dodaj 500 nanomolar JC-1, a następnie wznowij akwizycję. Sygnał stosunku JC-1 powinien wzrosnąć, co wskazuje na pobieranie barwnika przez aktywne mitochondria. Kontynuuj rejestrację do momentu, aż sygnał JC-1 osiągnie plateau.

Zazwyczaj w ciągu pięciu minut należy dodać chlorek wapnia do stężenia końcowego 20 micromolar. Powinien być widoczny natychmiastowy wzrost sygnału stosunku Fluor FF, reprezentujący zwiększoną obecność wapnia w buforze assay, a następnie stopniowy spadek wynikający z mitochondrialnego poboru wapnia. Sygnał stosunku JC one powinien wykazywać krótki, przejściowy spadek świadczący o niewielkiej depolaryzacji błony mitochondrialnej.

Gdy sygnał stosunku FF w ER powróci do poziomu podstawowego, zazwyczaj w ciągu od 1 do 1,5 minuty po podaniu kolejnych 20 µM chlorku wapnia, należy kontynuować pulsowanie w stałych odstępach czasu, aż do momentu, gdy mitochondria przestaną akumulować wapń i zaczną uwalniać go do buforu testowego. Otwarcie poru przejścia przepuszczalności mitochondrialnej jest wizualizowane przez jednoczesny wzrost sygnału stosunku FF w URA w wyniku uwalniania wapnia. Obserwuje się spadek stosunku sygnału JC-1 z powodu załamania potencjału błonowego oraz spadek rozpraszania światła z powodu obrzęku mitochondriów wyizolowanych z myszy C57BL/6J.

Jak pokazano w tym filmie, zużycie tlenu mierzono następnie podczas oddychania w stanie trzy w obecności bursztynianu i ADP oraz podczas oddychania w stanie cztery po zużyciu ADP, jak tutaj przedstawiono; dodanie ADP zwiększa zużycie tlenu ze względu na fosforylację oksydacyjną, a następnie zużycie tlenu zwalnia. Po zużyciu całego ADP reakcję izolowanych mitochondriów na rozprzęganie mierzy się poprzez dodanie CCCP; w obecności CCCP szybkość zużycia tlenu jest wyższa niż podczas oddychania w stanie trzy, co pozwala ocenić integralność błon izolowanych mitochondriów.

Zużycie tlenu mierzono w obecności bursztynianu i DP, a następnie po dodaniu cytochromu C. Jak widać, dodanie cytochromu C nie zwiększa znacząco zużycia tlenu w stosunku do DP i bursztynianu, co wskazuje, że nienaruszone błony mitochondrialne nie są przepuszczalne dla cytochromu C. W celu oceny przejścia przepuszczalności mitochondrialnej, otwarcie porów w izolowanych mitochondriach serca posłużyło jako wskaźnik pojemności retencji wapnia w mitochondriach. Przejście przepuszczalności mitochondrialnej i otwarcie porów wywoływano poprzez sekwencyjne dodawanie 20 µM.

Stężenie chlorku wapnia, poziom wapnia pozymitochondrialnego oraz potencjał błonowy mierzono za pomocą wskaźników ratiometrycznych. URA FF przedstawiono jako zieloną krzywą, a JC-1 jako czerwoną krzywą; obrzęk mitochondriów mierzono poprzez rejestrację rozpraszania światła przy 525 nm, co przedstawiono czarną krzywą. Specyficzność sygnałów JC-1 i obrzęku przetestowano z użyciem 1 µM CCCP oraz 5 µg/mL toksyny mikrobialnej etin; jak widać tutaj, pobieranie wapnia przez mitochondria wiąże się z lekką depolaryzacją błony mitochondrialnej.

Po czterech impulsach wapnia otwarcie porów przejścia przepuszczalności mitochondrialnej objawia się wzrostem URA FF, co wskazuje na uwalnianie wapnia. Spadek JC-1 wskazuje na zapadnięcie potencjału błonowego i zwiększenie objętości macierzy mitochondrialnej, co objawia się redukcją rozpraszania światła jako markerem obrzęku, co pozwala zweryfikować specyficzność otwarcia porów przejścia przepuszczalności mitochondrialnej. Te same pomiary wykonano w obecności cyklosporyny A, która wiąże się z komponentem porów przejścia przepuszczalności mitochondrialnej, cyklofiliną D. Jak pokazano na tej rycinie, obecność jednego mikromola cyklosporyny A zwiększa liczbę impulsów chlorku wapnia wymaganych do otwarcia porów przejścia przepuszczalności mitochondrialnej w porównaniu z próbką kontrolną.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat oceny otwarcia poru przejścia przepuszczalności mitochondrialnej w izolowanych mitochondriach serca. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest uzyskanie wysokiej jakości izolowanych mitochondriów. Dlatego ważne jest przeprowadzenie pomiarów kontroli jakości przed wykorzystaniem mitochondriów w dalszych eksperymentach.