Mikrodializa etanolu podczas operacyjnego samopodawania etanolu oraz oznaczanie etanolu metodą chromatografii gazowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest monitorowanie poziomu etanolu w dializacie mózgowym podczas sesji samopodawania etanolu. Aby porównać ten pomiar z jednoczesnymi zachowaniami związanymi z samopodawaniem, w pierwszej kolejności chirurgicznie implantuje się prowadnicę do mikrodializy, kaniulę oraz śrubę mocującą, a następnie szkoli szczury w operacyjnym samopodawaniu etanolu. Drugim krokiem jest habituacja szczurów do uwięzi etapu głowowego, aby nie utrudniała ona samopodawania etanolu podczas mikrodializy.

Następnie przeprowadza się mikrodializę podczas sesji samopodawania etanolu, w trakcie której przygotowywana jest część dializatu do analizy zawartości etanolu. Następnie próbki dializatu analizuje się pod kątem stężenia etanolu przy użyciu chromatografu gazowego z detekcją podczas jonizacji płomieniowej. Ostatecznie otrzymane wyniki obrazują przebieg czasowy docierania etanolu do badanego obszaru mózgu podczas sesji samopodawania etanolu.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak nakłucie ogona lub żyły saphrenous, jest to, że procedura ta jest minimalnie inwazyjna w momencie pobierania próbek i pozwala na pomiar stężenia leku w czasie w badanym obszarze mózgu, podczas gdy zwierzę wykonuje zadanie behawioralne. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą będą napotykać trudności, ponieważ wymaga ona szeregu specjalistycznych umiejętności, z których wiele można nabyć jedynie poprzez wielokrotną praktykę lub doświadczenie. Procedurę będzie demonstrował Jeffrey Dilley, student wspierający badania w naszym laboratorium.

Wszystkie przedstawione procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Teksańskiego i są zgodne ze wszystkimi regulacjami dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystania. Uniwersytet Teksański w Austin jest placówką akredytowaną przez ALAC; do tych eksperymentów z mikrodializą behawioralną wykorzystuje się szczury linii Long Evans, którym chirurgicznie wszczepiono kaniulę o rozmiarze 21 G nad odpowiednim obszarem mózgu. Wszystkie zwierzęta powinny przejść co najmniej tydzień opieki i rekonwalescencji po operacji i być zdrowe przed rozpoczęciem następujących procedur.

Umieść szczura w komorze operantowej Med Associates, wyposażonej w chowany dźwignia Lichter oraz rurkę z dozownikiem, i wytrenuj go w naciskaniu dźwigni w celu uzyskania dostępu do 10% roztworu sacharozy. Po wytrenowaniu szczura w reagowaniu na roztwór sacharozy, wprowadź go na odpowiedni schemat treningowy, podczas którego etanol jest stopniowo dodawany do roztworu w trakcie wielu sesji picia w noc poprzedzającą przedostatnią sesję operantową. Po znieczuleniu zwierzęcia i sprawdzeniu stopnia sedacji, przymocuj sprężynę wiązania do śruby wiązania na etapie głowowym szczura, aby przyzwyczaić go do aparatury, która składa się z dźwigni przeciwwagi, ramienia, obrotowego wiązania, sprężyny i statywu z pierścieniem.

Pozostaw szczura na noc w pomieszczeniu operacyjnym w jego domowej klatce z dostępem do ściółki, pokarmu i wody, a następnie następnego dnia przeprowadź sesję treningową z użyciem uwięzi i towarzyszącego sprzętu w dniu poprzedzającym eksperyment z mikrodializy. Po znieczuleniu szczura izofluranem sprawdź stopień sedacji, wykonując ucisk palca u nogi, a następnie wprowadź sondę do mikrodializy perfundowaną sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Odpowiednio przymocuj sondę, a następnie ustaw szybkość przepływu sondy na 0,2 µL na minutę.

Umieść szczura w jego domowej klatce w pomieszczeniu z aparaturą do warunkowania instrumentalnego, aby spędził tam noc z zainstalowanym całym sprzętem do dializy oraz z dostępem do pożywienia i wody ad libitum. Dzień po wprowadzeniu sondy, co najmniej dwie godziny przed rozpoczęciem eksperymentu, zwiększ przepływ sondy do wartości roboczej. Za pomocą strzykawki Hamiltona sprawdź, czy szybkość przepływu sondy jest stabilna i wynosi co najmniej 90% ustawionego przepływu.

W przypadku oceny neuroprzekaźników w próbkach z dializy, należy pobierać próbki podczas wszystkich faz eksperymentu. Rozpocznij od zbierania próbek z dializy, gdy zwierzę znajduje się w klatce domowej. Próbki należy przechowywać w odpowiedni sposób do późniejszej analizy.

Ostrożnie przenieś szczura do komory operantowej i uruchom program operantowy sterujący komorą. Kontynuuj pobieranie próbek, podczas gdy szczur czeka na wysunięcie dźwigni do komory, pobierając dwie próbki przed wysunięciem dźwigni. Rozpocznij pobieranie części każdej próbki dializatu do analizy etanolu, pipetując odpowiednią alikwotę dializatu do szklanej fiolki o objętości 2 ml i zamykając fiolkę szczelnym septem; próbki etanolu pipetuj i zamykaj szybko.

Ponieważ etanol jest lotny, a objętość próbki jest niewielka, niespójne lub powolne przygotowanie próbek doprowadzi do nieprawidłowych wyników. Pozostałą część należy przechowywać do analizy neuroprzekaźników. 20-minutowy okres picia rozpoczyna się po tym, jak program komputerowy Med Associates wysunie dźwignię do komory i szczur naciśnie ją, aby uzyskać dostęp do butelki z roztworem do picia.

Nadal pobieraj próbki przez cały okres podawania napoju; po zakończeniu tego okresu program komputerowy wycofa butelkę z komory. Pozostaw zwierzę w komorze na dodatkowe 20 minut po zakończeniu podawania napoju, pod koniec eksperymentu z mikrodializy. Po znieczuleniu szczura usuń sondę.

Jeśli zwierzę nie zostanie niezwłocznie poddane humanitarnej eutanazji, należy ponownie wprowadzić obturator, aby zapewnić wizualizację toru sondy. Mózg należy pobrać w ciągu trzech dni od zakończenia eksperymentu. Próbki należy przeanalizować wraz z zewnętrznymi wzorcami etanolu przy użyciu chromatografu gazowego z detektorem jonizacji płomieniowej, autosamplera headspace podgrzanego do 50 °C oraz kolumny kapilarnej z helem jako fazą ruchomą.

Do rejestracji i analizy chromatogramów należy wykorzystać oprogramowanie stacji roboczej do chromatografii, aby przygotować system do analizy etanolu. Należy użyć cyrkulacyjnej łaźni wodnej do podgrzania płytki autosamplera oraz otworzyć butle z powietrzem i wodorem. Następnie należy uruchomić program startowy.

Po przygotowaniu rozpocznij 20-minutowe wypalanie w celu dekontaminacji włókna. Przygotuj standardy, używając kolby miarowej o pojemności 100 ml, aby rozcieńczyć 238 µL 95% etanolu wodą do końcowej objętości 100 ml. Do utworzenia serii standardów zastosuj rozcieńczenia seryjne w stosunku jeden do jednego.

Przenieś standardy pipetą do szklanych fiolek i zapieczętuj je w taki sam sposób, w jaki przygotowano próbki. Należy pamiętać o wykonaniu próby ślepej z wodą wraz ze standardami. Umieść standardy i próbki w tacy autosamplera i podgrzewaj je do czasu całkowitego odparowania całej alikwoty cieczy.

Aby przeprowadzić analizę wzorców i próbek, należy sporządzić listę próbek z zaznaczeniem, która próbka znajduje się w którym gnieździe autosamplera, oraz z informacją, że każda próbka powinna zostać przebita. Następnie należy przekierować pliki z danymi do wybranego folderu, wybrać odpowiednią metodę analizy próbek i rozpocząć pomiar. Po zakończeniu analizy wszystkich próbek należy sprawdzić, czy program prawidłowo zintegrował każdy pik.

Nanieś na wykres wysokość piku w funkcji każdego znanego wzorca zewnętrznego. Stężenie etanolu. Wykorzystaj funkcję liniową wyznaczoną przez te punkty, aby zinterpolować stężenie etanolu w każdej próbce dializatu.

Na tej rycinie przedstawiono przykładowe chromatogramy dla trzech stężeń wzorców etanolu oraz jeden chromatogram dla próbki dialyzatu szczura pobranej na koniec sesji samopodawania etanolu. Piki etanolu powinny być względnie symetryczne, mieć spójne czasy retencji i stosunek sygnału do szumu większy niż 10. Niespełnienie tych kryteriów oznacza, że system wymaga konserwacji; prawidłowo przygotowane wzorce w wysokiej jakości chromatografii pozwalają uzyskać liniową krzywą wzorcową, która jest wykorzystywana do obliczenia stężenia etanolu w próbkach dialyzatu pobranych od zwierząt podających sobie etanol w trakcie procesu samopodawania.

Obliczone stężenia etanolu w dializacie nie są korygowane o odzysk sondy in vivo i stanowią jedynie ułamek stężenia etanolu w tkance mózgowej. Jeśli wymagana jest ilościowa mikrodializa etanolu, eksperymentalnie wyznacza się frakcję ekstrakcji etanolu dyfundującego z przestrzeni zewnątrzkomórkowej do sondy. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura zajmuje około czterech do pięciu godzin.

Będzie to zależeć od długości sesji behawioralnej. Pomyślne zakończenie fazy mikrodializy w eksperymencie w dużej mierze zależy od jakości faz przygotowawczych. Podczas próbowania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że szczury są dobrze oswojone i że przyzwyczajono je do wszelkich potencjalnie rozpraszających bodźców, które mogłyby wystąpić podczas eksperymentu z dializą, tak aby zachowanie zwierzęcia w zakresie samopodawania nie zostało zaburzone.