Metoda ekstruzji z kontrolowanym stałym ciśnieniem do przygotowania nano-rozmiarowych pęcherzyków lipidowych

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest przedstawienie solidnej metody przygotowania biologicznie istotnych pęcherzyków lipidowych. Osiąga się to poprzez mieszanie i przenoszenie fosfolipidów do fiolek szklanych i ich hydratację buforem wodnym w celu utworzenia wielowarstwowej zawiesiny SLE. W drugim kroku przeprowadza się metodę zamrażania i rozmrażania, co w konsekwencji prowadzi do powstania pęcherzyków Ella z pęcherzyków wielowarstwowych.

Następnie zawiesinę liposomów przepuszcza się przez ekstruder, stosując określone optymalne ciśnienie w celu wytworzenia jednorodnych pęcherzyków lipidowych o pożądanej wielkości. Otrzymane wyniki wykazały spójne submikronowe rozmiary pęcherzyków w analizie dynamicznego rozpraszania światła oraz analizie śledzenia nanocząstek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak sonikacja i sedymentacja, jest zastosowanie systemu kontroli ciśnienia z określonymi optymalnymi przepływami azotu w celu efektywnego przygotowania pęcherzyków lipidowych o określonej wielkości.

Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować szklaną fiolkę o pojemności 20 ml z nakrętką wyłożoną teflonem; przed użyciem całe szkło laboratoryjne oraz strzykawki należy oczyścić chloroformem, aby zapobiec kontaminacji. Za pomocą hermetycznej szklanej strzykawki o pojemności 250 µL przenieść 100 µL chloroformu czystości reagentowej do szklanej fiolki. Następnie, używając hermetycznej szklanej strzykawki o pojemności 100 µL, dodać 30 µL metanolu czystości reagentowej do tej samej szklanej fiolki.

Przygotuj 2 mM roztwór lipidowy POPC, POPE i cholesterolu, przenosząc 216 µL roztworu POPC o stężeniu 10 mg/mL, 42 µL roztworu POPE o stężeniu 10 mg/mL oraz 20 µL roztworu cholesterolu o stężeniu 11 mg/mL do szklanej fiolki o pojemności 20 mL. Odparuj rozpuszczalniki organiczne, stosując powolny przepływ argonu lub azotu, aż do powstania cienkiej warstwy lipidów na dnie fiolki. Umieść otwartą szklaną fiolkę w deskrykatorze próżniowym na co najmniej 30 minut.

Aby usunąć pozostałości rozpuszczalnika, przenieś dwa mililitry buforu, który wcześniej przeszedł przez filtr 0,2 mikrona, do szklanej fiolki w celu hydratacji lipidów. Inkubuj mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc i wykorzystaj w ciągu 48 godzin dla liposomów o rozmiarach od 30 do 100 nanometrów. Zamroź zawiesinę liposomów w ciekłym azocie przez 15 sekund.

Następnie rozmroź zawiesinę liposomów, używając bloku grzewczego w temperaturze 42 °C przez około trzy minuty. Powtórz proces zamrażania i rozmrażania łącznie pięć razy. Zamrażanie, a następnie rozmrażanie, prowadzi do powstania jednobłonowych pęcherzyków (ULV) z pęcherzyków wielobłonowych i zwiększa wydajność zatrzymywania lipidów podczas ekstruzji.

Następnie przygotuj układ do ekstruzji, postępując zgodnie z instrukcjami Avastin, aby starannie zmontować ekstruder lipo so fast LF 50. Prawidłowy montaż jest kluczowy, aby zapobiec wyciekom azotu, co wpływa na pożądane szybkości przepływu. Aby zapewnić powodzenie procesu, dokładnie wykonaj następujące kroki.

Aby zapewnić szczelność, umieść sitko wspierające z dużym otworem w podstawie filtra wspierającego, a następnie nałóż okrągły wkład centralny, jeden dysk odpływowy i jedną membranę poliwęglanową. Na membranie umieść mały czarny pierścień O-ring i zamocuj go do podstawy filtra wspierającego.

Przymocuj górny wycisk filtracyjny, dokręcając cztery śruby w czterech odpowiadających im otworach. Zamontuj jednostkę wyciskania filtra pod dużym cylindrem wyciskowym. Dodaj roztwór liposomów do cylindra znajdującego się nad cylindrem wyciskowym.

Umieść duży okrągły pierścień O-ring, wąską nakrętkę, duży okrągły pierścień O-ring i okrągłą nakrętkę. Przymocuj regulator gazu do górnej części cylindra ekstrudera i zamknij wszystkie zawory, w tym zawór bezpieczeństwa, aby zapobiec wyciekom powietrza. Pod jednostką filtra ekstrudera ustaw szklaną fiolkę o pojemności 20 milliliter lub kolbę Erlenmeyera o pojemności 50 milliliter.

Do regulatora podłączony jest zawór bezpieczeństwa, który otwiera się, gdy ciśnienie przekroczy 600 PSI. Włączam dopływ azotu i otwieram zawór gazowy podłączony do ekstrudera. Zwiększam ciśnienie azotu do 25 PSI dla liposomów o rozmiarze 400 nanometrów, do 125 PSI dla liposomów o rozmiarze 100 nanometrów oraz do 400–500 PSI dla liposomów o rozmiarze 30 nanometrów. Obserwuję zawiesinę liposomów, aż zostanie wypchnięta przez azot do pojemnika.

Kontynuuj przepływ azotu, aż do momentu, gdy nie będzie już widoczna ciecz. Przenieś materiał przez filtr ekstrudera do fiolki szklanej w celu przeprowadzenia analizy DLS. Najpierw przygotuj 50 µL roztworu liposomów o stężeniu 20 µM rozcieńczonego w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS).

Następnie włącz zasilacz oraz źródło światła lampy. Uruchom oprogramowanie DynaPro. W ustawieniach oprogramowania wybierz model algorytmu służący do wykrywania liposomów o pożądanym rozmiarze.

Po podłączeniu urządzenia, należy pipetować 14 µL próbki liposomów do kuwety kwarcowej i umieścić ją w uchwycie na próbkę, a następnie nacisnąć przycisk start; po wykonaniu około 20 do 30 pomiarów należy nacisnąć przycisk stop. Następnie należy przeanalizować piki średnicy liposomów zarejestrowane na histogramie. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) rozpoczyna się od przygotowania 500 µL 0,1 µM roztworu liposomów rozpuszczonych w PBS, a następnie przepłukania komory pomiarowej wodą i etanolem.

Następnie osusz komorę próbkową za pomocą beztkankowego ręcznika papierowego. Włącz zasilacz lasera oraz komputer, a następnie wprowadź 300 µL 0,1 M roztworu liposomów do komory próbkowej. Uruchom system kontroli temperatury oraz oprogramowanie do analizy śledzenia nanocząstek.

Naciśnij przycisk przechwytywania, aby włączyć laser. Użyj regulacji poziomej i pionowej, aby przesunąć stolik i ustawić ostrość mikroskopu. Ustaw żądaną temperaturę oraz czas rejestracji.

Naciśnij przycisk nagrywania, aby zarejestrować wiele klatek obrazu cząsteczek liposomów przez określony czas. Przeanalizuj piki odpowiadające średnicom liposomów na histogramie, który śledzi ruch każdej cząsteczki. DLS jest uznaną metodą polegającą na zbieraniu rozproszonego światła w celu oznaczenia średnicy cząstek i została ona zastosowana do wyznaczenia wielkości liposomów.

Nawodnione liposomy poddano ekstruzji przez membrany poliwęglanowe o różnych rozmiarach porów i pod różnymi ciśnieniami, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Średnice liposomów zmierzone metodą DLS dla rozmiaru porów 30 nanometrów wynosiły 66 ± 28 nanometrów. Dla rozmiaru porów 100 nanometrów wynosiły 138 ± 80 nanometrów, a dla rozmiaru porów 400 nanometrów wynosiły 360 ± 25 nanometrów.

Jako wzorzec kalibracyjny wykorzystano zawiesinę polerowanych kulek Irene o rozmiarze 50 nanometrów, dla których odnotowano średnicę 47 ± 16 nanometrów. Procent polidyspersyjności wskazuje na brak nakładania się rozmiarów liposomów. W analizie DLS typowe jest obserwowanie średnic większych niż 30 nanometrów ze względu na znaną tendencję tego przyrządu do faworyzowania większych cząstek.

Pomimo tego ograniczenia instrumentalnego, krzywa kalibracyjna opisuje korelację liniową. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) to nowa technologia, która mierzy rozmiar każdej cząstki na podstawie bezpośrednich obserwacji dyfuzji w ośrodku ciekłym, niezależnie od współczynnika załamania światła lub gęstości cząstek. Tę technikę o wysokiej rozdzielczości można wykorzystać jako uzupełnienie pomiaru liposomów metodą DLS; w metodzie NTA zarejestrowano średnice 95 ± 48 nanometrów oraz 356 ± 51 nanometrów dla dwóch roztworów polistyrenu o rozmiarach 100 nanometrów i 400 nanometrów, które zostały użyte do kalibracji.

Roztwory lipidów mają średnice bardziej porównywalne z wynikami DLS, które wykazały średnie rozmiary wynoszące 29 ± 14 nm dla rozmiaru porów 30 nm, 95 ± 17 nm dla rozmiaru porów 100 nm oraz 359 ± 73 nm dla rozmiaru porów 400 nm. NTA może być bardziej uniwersalną techniką charakteryzacji w celu ilościowego oznaczenia cząstek mikroskopowych, ponieważ jej czułość pozwala na pomiary cząstek o rozmiarach od 50 do 1000 nm. Krzywa kalibracyjna wykazuje liniową korelację między rozmiarem porów membrany poliwęglanowej a zarejestrowaną średnicą NTA. Obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej z barwieniem negatywowym pokazują, że rozmiary liposomów po ekstruzji przez pory o wielkości 3, 100 i 400 nm są wyraźnie od siebie odróżnialne.

Powiększenie ustawiono na 25 000 razy, a pasek skali reprezentuje 0,5 mikrona. Przeprowadzono eksperyment z przebiegiem czasowym z wykorzystaniem trzech rozmiarów liposomów. Pomiar DLS wykonano dla każdego roztworu liposomów bezpośrednio po ekstruzji.

Wszystkie roztwory liposomów przechowywano w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Ich średnice ponownie zmierzono za pomocą DLS po nocnej inkubacji. Po 60-godzinnym okresie inkubacji nie zaobserwowano niemal żadnych zmian. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że wielokrotne przepuszczenie roztworu przez filtr ekstruzyjny poprawi homogeniczność roztworu pęcherzykowego.

Należy również pamiętać o stosowaniu szklanych fiolek i strzykawek do przygotowania próbek, aby zapobiec zanieczyszczeniom wynikającym z wymywania składników z probówek polipropylenowych przez chloroform.