Ulepszona wizualizacja przerzutów do płuc w rozdzielczości pojedynczych komórek u myszy poprzez połączoną perfuzję in-situ tkanki płucnej i barwienie X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ

Ogólnym celem niniejszej procedury jest poprawa wykrywalności mikroprzerzutów w płucach myszy ex vivo przy jednoczesnym zachowaniu architektury napowietrzonych płuc. Osiąga się to poprzez wstępną perfuzję płuc in situ za pomocą PBS w celu usunięcia krwi, która stanowi główne źródło tła kolorystycznego w tej tkance. Kolejne etapy polegają na napowietrzeniu płuc poprzez wstrzyknięcie PFA, a następnie ich odcięcie, aby utrwalić tkankę płucną w stanie napowietrzenia.

Następnie usuwa się płuco i utrwala je dalej w PFA lub poszczególne płaty płuc są zatapiane w celu wykonania krioprzekrojów. Końcowe etapy polegają na barwieniu tkanek w roztworze Xal i wizualizacji komórek nowotworowych LA zag; ostatecznie przerzuty w całych płatach płuc lub w przekrojach tkanki płucnej można wykryć na poziomie pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopu binokularnego lub mikroskopu świetlnego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak sky standing on its own, jest znaczna poprawa wykrywalności mikroprzerzutów dzięki usunięciu tła związanego z krwią.

Protokół należy rozpocząć od znieczulenia myszy poprzez podanie wewnątrzbrzuszne ketaminy, ksylazyny i acepromazyny w około 150 µL PBS. Po ustąpieniu odruchów bólowych u myszy, należy unieruchomić zwierzę na stole operacyjnym. Następnie należy odsunąć i wygładzić sierść za pomocą 70% etanolu.

Otwórz skórę od brzucha aż do szyi. Odciągnij skórę na boki lub usuń ją. Ostrożnie otwórz otrzewną w klatce piersiowej, aby zapobiec przerwaniu dużych naczyń, takich jak żyły szyjne.

Zwiększy to wydajność perfuzji. Teraz należy przekciąć żyłę główną dolną serca pod wątrobą, używając strzykawki 20 ml z igłą o rozmiarze 21-24 G. Powoli wstrzyknij od 10 do 15 ml PBS do prawej komory bijącego serca, aż płuca staną się całkowicie białe, a serce przestanie bić.

Następnie należy zacisnąć naczynia krwionośne powyżej wątroby i przepony za pomocą zacisku naczyniowego. Napełnić strzykawkę o pojemności 10 mililitrów 3% paraformaldehydem i za pomocą igły o rozmiarze od 21 do 24 G wstrzyknąć do prawej komory około dwóch mililitrów.

Odsłoń tchawicę poza klatką piersiową i napompuj płuco, wstrzykując do tchawicy od zewnątrz klatki piersiowej około trzech mililitrów aldehydu. Następnie, niezwłocznie po wyjęciu igły, zacznij tchawicę w miejscu nakłucia za pomocą zacisku naczyniowego i odczekaj 10 minut, aby umożliwić utrwalenie. Następnie przetnij naczynia krwionośne powyżej zacisku naczyniowego.

Następnie zdejmij zacisk i wstrzyknij około dwóch mililitrów PBS do prawej komory, aby usunąć nadmiar formaldehydu. Przebij igłą dolne części wszystkich płatów płuc i zdejmij zacisk naczyniowy z tchawicy. Teraz wstrzyknij od trzech do pięciu mililitrów rozcieńczonego roztworu do zatapiania do tchawicy w odstępach czasowych od poprzedniej iniekcji.

Przerwij wstrzykiwanie, gdy paraformaldehyd w płatach płuc zostanie zastąpiony przez roztwór. Ostrożnie wyjmij płuca, wyciągając serce pęsetą i przecinając więzadła tkanki łącznej, naczynia krwionośne oraz tchawicę. Upewnij się, że serce pozostaje połączone z płucami.

Odłóż jeden płat do preparowania skrawków mrożonych, a pozostałą tkankę płucną wykorzystaj do barwienia całych organów. Umieść płuco w plastikowym kubku z dopasowaną pokrywką i utrwal je w 2% formaldehydzie w PBS. Połóż kawałek gazy na płucach, aby utrzymać je w roztworze, i pozostaw w temperaturze pokojowej na 30 minut.

Po pół godzinie należy usunąć roztwór utrwalający i dokładnie przemyć tkankę PBS-em 3 razy. Przygotować świeży, gotowy do użycia roztwór Xal, rozcieńczając 1 mL roztworu stokowego Xal w stosunku 1:40 w podstawowym roztworze barwiącym, a następnie wlać co najmniej 10 mL tego roztworu do naczynia. Płuca należy przykryć kawałkiem gazy. Luźno zamknąć pokrywę, aby umożliwić wymianę powietrza, i inkubować w temperaturze 37°C przez 3 do 5 godzin, chroniąc przed światłem.

Po inkubacji należy usunąć roztwór xal. Płuca należy przepłukać raz PBS, aby usunąć pozostałości roztworu xal, a następnie dodać co najmniej 10 milliliters 4% paraformaldehydu w PBS. Tkanka jest teraz gotowa do badania histologicznego i może być przechowywana przez dłuższy czas w 4% PFA w temperaturze four degrees Celsius.

Zacznij od wypełnienia jednej trzeciej formy do zatapiania nierozcieńczonym medium zatapiającym poly forze. Następnie umieść płat płuca w formie i dodawaj medium, aż płat zostanie całkowicie przykryty. Uważaj, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza, a następnie inkubuj zatopiony płat w temperaturze 4 °C przez 20 minut.

Następnie przygotuj zakonserwowane płuca do cięcia, zamrażając je powoli w mieszaninie suchego lodu i izopentanu. W razie potrzeby można je teraz przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu przechowywania. Na kriostacie wytnij krioprzekroje płata o grubości od 7 do 10 µm i przymocuj je do dostępnych w handlu szkiełek przeznaczonych do krioprzekrojów. Po przymocowaniu natychmiast inkubuj przekroje w roztworze barwiącym XAL w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w komorze z nawilżaczem. Następnego dnia przepłucz szkiełka w PBS dwukrotnie, przez 5 minut podczas każdego płukania.

Następnie krótko wypłucz preparaty w wodzie destylowanej. Teraz przeprowadź przeciwbarwienie preparatów przy użyciu nuclear fast red przez 10 sekund, aby uzyskać słabe przeciwbarwienie, które sprawi, że xal będzie bardziej widoczny, a następnie natychmiast spłucz barwnik wodą destylowaną. Aby uzyskać ciemniejsze przeciwbarwienie, wydłuż czas do 30 sekund lub więcej.

Preparaty należy zamontować przy użyciu medium do montażu preparatów immunocytochemicznych. Ponownie zbadano tworzenie przerzutów w modelach osteosarkoma (OS) myszy DONLM8. Wykorzystano opisane tutaj reprezentatywne obrazy perfundowanych i nieperfundowanych płuc myszy, którym jednocześnie wstrzyknięto transdukowane lacy oraz nietransdukowane kontrolne komórki DONLM8, a także płuc myszy, którym wstrzyknięto kontrolne komórki DON.

Przerzuty makroskopowe i mikroskopowe pozostały niewykrywalne w płucach nieperfundowanych i perfundowanych. Co ciekawe, u myszy wstrzykniętych komórkami dun LA Z barwienie xgl ujawniło niebieskie ogniska mikroprzerzutowe pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek na powierzchni płuc nieperfundowanych; perfuzja i fiksacja płuc in situ dodatkowo poprawiły wykrywalność mikroprzerzutów dun la z, jednak nie zaobserwowano rozrostu do ognisk makroskopowych u myszy wstrzykniętych kontrolnymi komórkami LM eight. W płucach nieperfundowanych rozpoznano przezroczyste, ledwo wykrywalne ogniska makroprzerzutowe o średnicy większej niż 0,1 millimeter. Perfuzja płuc nie poprawiła wykrywalności tych ognisk.

Jednak u myszy, którym wstrzyknięto komórki LAC Z, na powierzchni nieprzepłukanych organów wykryto liczne niebieskie makroprzerzuty zabarwione X gal. Na powierzchni nieprzepłukanych organów stwierdzono również obecność mikroprzerzutów. Ponadto perfuzja płuc dodatkowo poprawiła wykrywalność makro- i mikroprzerzutów.

W konsekwencji mikro- i makroprzerzuty stały się widoczne z większą gęstością i w większej liczbie, głównie dzięki przezroczystości perfundowanej tkanki, w której widoczne stały się również ogniska znajdujące się pod powierzchnią narządu. Dodatkowa analiza histologiczna z wykorzystaniem krioprzestrojów tkanki płuc potwierdziła poprawę wykrywalności przerzutów do płuc u myszy, którym wstrzyknięto komórki LAX Z transdukowane i LM eight, a także u myszy z guzami pierwotnymi pochodzącymi z komórek Dun LAX Z. W przekrojach płuc zidentyfikowano mikroprzerzuty, a nawet pojedyncze ogniska komórkowe.

Nie zaobserwowano tego u myszy z guzami pierwotnymi poszczególnych komórek kontrolnych. Co więcej, przerzuty makroskopowe były również wyraźniej widoczne u myszy, którym wstrzyknięto komórki LM eight LA C, niż u zwierząt z kontrolnymi komórkami LM eight. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić perfuzję i utrwalenie płuc w ZI two oraz późniejsze barwienie przerzutów w wyciętych płucach.

Technika ta stanowi wysoce czułą metodę końcowego odczytu rozprzestrzeniania się przerzutów w płucach w dowolnym badaniu nad nowotworami, a także może służyć jako punkt odniesienia dla udoskonalenia obecnych technik obrazowania in vivo, takich jak micro ct PET i MRI, wykorzystywanych do wczesnego wykrywania ognisk przerzutowych.