Ilościowa ocena migracji komórek z wykorzystaniem testu ruchliwości w śladach fagokinetycznych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest umożliwienie ilościowego pomiaru motylowości komórkowej w czasie z wykorzystaniem testu motylowości komórek opartego na nanocząsteczkach złota. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie szklanych szkiełek podstawkowych do powlekania nanocząsteczkami złota. W szczególności szkiełka podstawkowe wolne od endotoksyn są powlekane żelatyną, a następnie wypalane.

Drugim krokiem jest redukcja kwasu chlorozłotowego, co doprowadzi do powstania nanocząsteczek złota, a następnie równomierne pokrycie szkiełek podstawowych powleczonych żelatyną otrzymanym roztworem. Następnie komórki nanosi się na szkiełka pokryte nanocząsteczkami złota na czas wymagany w eksperymencie. W kolejnym etapie żelatyna wyprze nanocząsteczki złota, tworząc ślady.

Ostatnim krokiem jest monitorowanie i kwantyfikacja ruchliwości komórek przy użyciu mikroskopii w celu obrazowania śladów pozostawionych przez poruszające się komórki. Ostatecznie, za pomocą bezpłatnego oprogramowania, przeprowadza się pomiary powierzchni tych śladów. Jedną z głównych zalet tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie time-lapse, jest fakt, że badanie to wymaga jedynie standardowego mikroskopu świetlnego, standardowej kamery oraz wykorzystuje bezpłatne oprogramowanie do analizy obrazów.

Ponadto test ten umożliwia łatwą analizę i porównanie wielu próbek przy użyciu metody pozwalającej na przesiewanie wysokoprzepustowe. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat wpływu różnych czynników fizjologicznych i ruchu komórek, można ją również zastosować w innych układach, np. w badaniach nad wpływem patogenów na ruchliwość zakażonych komórek. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ wymaga ona ścisłego przestrzegania objętości i temperatur wskazanych w protokole.

W niniejszym protokole szczególny nacisk położono na ocenę barwy końcowego roztworu wytrąconych nanocząsteczek złota w celu potwierdzenia powodzenia procesu. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ kroki testu ruchliwości śladów kinetycznych FGO są trudne do opanowania.

Zawierają one kilka procedur, które nie są powszechnie stosowane w laboratoriach biologii komórkowej i molekularnej. Aby przygotować szkiełka podstawowe pokryte żelatyną, należy najpierw zawiesić żelatynę w wodzie dejonizowanej, aby otrzymać roztwór o stężeniu końcowym 0,5 g na 300 ml, a następnie autoklawować mieszaninę przez 15 do 30 minut. Ważne jest, aby czynność tę wykonać w ciągu dwóch godzin od dodania żelatyny, pracując w komorze do hodowli tkanek.

Przygotuj szkiełka nakrywkowe do powlekania, przenosząc najpierw od ośmiu do dziewięciu wypłukanych kwasem szkiełek do plastikowej szalki o średnicy 100 mm. Upewnij się, że szkiełka nie stykają się ze sobą ani z krawędziami szalki. Ostrożnie nanieś pipetą od dwóch do trzech kropli żelatyny na każde szkiełko, unikając rozlania ich na dno szalki.

Następnie umieść szalkę zawierającą szkiełka podstawowe pokryte żelatyną w piekarniku i wygrzewaj w temperaturze 90 °C przez 10 minut. Po 10 minutach wyjmij szalkę z piekarnika i przenieś ją z powrotem do dygestorium do hodowli tkanek.

Ostrożnie odpipetuj nadmiar żelatyny. Umieść szalkę z powrotem w piekarniku i susz szkiełka nakrywki w temperaturze 70 °C przez 45 minut. Po wyschnięciu szkiełek wyjmij szalkę z piekarnika i przenieś ją z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza.

Używając ostrożnie sterylnej igły, delikatnie unieś jedną stronę szkiełka nakrywkowe. Następnie za pomocą sterylnej pęsety usuń pokryte żelatyną szkiełka nakrywkowe z szalki i umieść je w osobnych dołkach płytki 24-dołkowej. Kolejnym krokiem jest przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych złotem koloidalnym.

Rozpocznij od przygotowania 10 ml 0,5% roztworu cytrynianu sodu, pracując w komorze do hodowli tkanek; połącz 1,5 ml 14,5 mM roztworu kwasu chloraurycznego oraz 13,5 ml autoklawowanej wody dejonizowanej w sterylnej, wolnej od endotoksyn kolbie Erlenmeyera. W przypadku ośmiu do dziewięciu szkiełek nakrywkowych wynik powinien być w postaci bladonieżółtego roztworu. Kwas chlorauryczny jest toksyczny i należy z nim obchodzić się ostrożnie. Jest on również światłoczuły, dlatego etap gotowania należy przeprowadzić przy słabym oświetleniu.

Po osiągnięciu temperatury wrzenia roztworu należy zdjąć kolbę z płyty grzejnej i przenieść ją na mieszadło magnetyczne. Aby utworzyć koloidalne cząsteczki złota w roztworze, należy dodać 0,7 ml 0,5% roztworu cytrynianu sodu na każde 15 ml roztworu kwasu chlorozłotowego podczas mieszania, a następnie kontynuować mieszanie przez około dwie minuty. W tym czasie roztwór zmieni barwę z bladożółtej na przezroczystą, następnie na szarą, fioletową i w końcu na ciemnofioletową.

Zanim roztwór ostatecznie przybierze kolor czerwonego wina lub najlepiej rdzy, pobierz roztwór koloidalnego złota pipetą 10 ml i pozwól mu ostygnąć w pipecie przez jedną do dwóch minut, aż osiągnie temperaturę pokojową. Następnie nanieś od 0,5 do 1 ml roztworu na pokrywki szkiełce pokrywnego powlekane żelatyną w płytce 24-dołkowej. Umieść płytkę 24-dołkową z pokrywkami szkiełeczek pokrywnych pokrytymi złotem koloidalnym w inkubatorze w temperaturze 37 °C i inkubuj przez 30 minut. Po czasie niezbędnym do osadzenia się cząsteczek na pokrywkach szkiełeczek pokrywnych powlekanych żelatyną, sprawdź ich gęstość pod mikroskopem świetlnym.

Odpowiedni rozkład nanocząsteczek złota ułatwia szybkie i wydajne rozróżnienie krawędzi ścieżek ruchu. Optymalna gęstość zależy od wielkości komórek. Zbyt wysokie stężenie cząsteczek złota utrudnia ruch komórek, natomiast zbyt niskie stężenie cząsteczek złota ogranicza możliwość dokładnego wyznaczenia ścieżki motywności.

Z tego powodu w poszczególnych eksperymentach należy razem stosować wyłącznie szkiełka nakrywkowe wykonane z tej samej partii lub zweryfikowane pod kątem posiadania tej samej gęstości. Jeśli stężenie cząsteczek złota jest niewystarczające, należy dodać od 0,5 do 1 ml roztworu złota koloidalnego do szkiełek nakrywek pokrytych żelatyną. Jeśli jednak stężenie cząsteczek złota jest zbyt wysokie, jak w przypadku pokazanym tutaj, jedynym skutecznym rozwiązaniem jest ponowne przygotowanie roztworu złota koloidalnego i pokrycie nowych szkiełek nakrywek.

Jeśli gęstość cząsteczek jest prawidłowa, należy przenieść płytkę z powrotem do inkubatora w temperaturze 37°C i inkubować od jednej godziny do nocy. Następnie należy wypłukać niezwiązane cząsteczki złota, zanurzając laminki trzykrotnie w sterylnym roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Następnie pokryte koloidalnym złotem laminki należy przechowywać w dołkach czystej płytki 12-dołkowej wypełnionych PBS w temperaturze 4°C do momentu ich użycia. Laminki nie mogą wyschnąć i powinny zostać wykorzystane w ciągu dwóch do trzech miesięcy od daty przygotowania.

Kolejnym krokiem jest przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych koloidalnym złotem do hodowli komórkowej. Należy umieścić je w poszczególnych dołkach płytki 24-dołkowej, do których wcześniej dodano około 0,3 milliliters pożywki hodowlanej. Następnie należy przenieść od około 5 000 do 50 000 komórek na każde szkiełko nakrywkowe pokryte koloidalnym złotem. Liczba komórek będzie różnić się w zależności od typu komórek, jednak gęstość komórek musi być na tyle niska, aby zapobiec nakładaniu się śladów wielu komórek w tym samym obszarze.

Przykryć płytkę i umieścić ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO2 na okres od 6 do 24 godzin. W zależności od ruchliwości danego typu komórek, optymalny czas inkubacji należy ustalić doświadczalnie dla każdego rodzaju komórek. Po inkubacji należy utrwalić wszystkie szkiełka podstawowe, które nie będą analizowane natychmiast, najpierw zanurzając je dwukrotnie w PBS, a następnie inkubując w 3% paraformaldehydzie przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przy użyciu mikroskopu należy wykonać zdjęcia ścieżek utworzonych przez pojedynczą ruchomą komórkę na nieutrwalonych lub utrwalonych szkiełkach podstawowych. Powiększenie stosowane do fotografowania ścieżek komórkowych różni się w zależności od typu komórek. Jednak w każdym badaniu należy stosować to samo powiększenie, aby umożliwić porównanie wyników.

W przypadku monocytów dobrze sprawdza się powiększenie 40x; przy użyciu bezpłatnego oprogramowania, takiego jak ImageJ, JNIH Image lub Image Tool, wyznacza się średnią powierzchnię oczyszczoną z koloidalnego złota przez 10 do 20 lub więcej komórek dla każdej próbki na podstawie wykonanych zdjęć. Przedstawiony tutaj obraz pokazuje ścieżkę oczyszczenia z cząsteczek koloidalnego złota przez pojedynczy nieustymulowany monocyt, wykonaną przy użyciu obiektywu 40x. Komórki nie mobilne tworzą charakterystyczne, małe, owalne lub okrągłe ślady wokół siebie, co wskazuje na niski bazowy poziom ruchu. Z kolei komórki o wysokiej mobilności charakteryzują się ruchem kierunkowym w postaci wydłużonych ścieżek i większą całkowitą powierzchnią ze względu na ich nieregularne kształty.

Ścieżki komórek najlepiej analizować, używając narzędzia freehand w oprogramowaniu Image J do obrysowania ich obszaru. Pomiary ilościowe powierzchni można następnie przeprowadzić za pomocą narzędzia measure w menu analizy Image J. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ścisłym przestrzeganiu objętości i temperatur wskazanych w protokole, ponieważ odchylenia mogą silnie wpłynąć na końcowe wyniki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować szkiełka zakrywkowe powlekane żelatyną, jak przygotować nanocząsteczki złota oraz szkiełka zakrywkowe powlekane nanocząsteczkami złota, a także jak monitorować i ilościowo oceniać ruch komórek przy użyciu mikroskopii świetlnej.

Należy pamiętać, że praca z wrzącymi roztworami na płycie grzejnej, a w szczególności opary z wrzącego roztworu kwasu fluorowego, kwasu cytrynowego i cytrynianu sodu, może być niebezpieczna; podczas przeprowadzania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w dygestorium oraz zachowanie zdrowego rozsądku.