Kompleksowe profilowanie regulacji dopaminy w istocie czarnej i polu brzuszno-przyponowym

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zmaksymalizowanie ilości informacji uzyskanych z odczytów molekularnych związanych z regulacją dopaminy z pojedynczej sekcji tkanki pobranej z obszarów somatodendrytycznych śródmózgowia. Osiąga się to najpierw poprzez wykonanie precyzyjnej sekcji w celu oddzielenia istoty czarnej od brzusznego obszaru segmentowego. Drugim krokiem jest przygotowanie tkanek do analizy poziomu dopaminy metodą HPLC oraz dalsze przetwarzanie wytrąconego białka endogennego w celu przeprowadzenia analizy.

Następnie, opracowanie wytrąconego białka w celu oznaczenia całkowitej zawartości białka pozwala ustalić, które białka regulujące dopaminę lub fosforylację białek można zmierzyć w powiązaniu z odczytem zawartości dopaminy w tkance w próbce. Ostatecznie, analizy dopaminy i jej białek regulacyjnych w poszczególnych somatodendrytycznych obszarach śródmózgowia pozwalają na wyciągnięcie wniosków dotyczących mechanizmów molekularnych związanych z regulacją dopaminy.

Monoaminy wpływają na wiele wyników behawioralnych, dlatego badacze w dziedzinie uzależnień, biologii i dysfunkcji lokomocyjnych, szczególnie w chorobie Parkinsona, są bardzo zainteresowani tym, jak monoaminy, takie jak dopamina, którą badamy w moim laboratorium, oddziałują na wyniki behawioralne. Znaczenie badania monoamin można dodatkowo podkreślić, jeśli zrozumiemy, w jaki sposób są one regulowane na poziomie molekularnym. Zaletą naszej techniki jest to, że z jednej próbki pobranej z tkanki OUN możemy uzyskać wiele odczytów, co pozwala nam na pełną analizę tego, jak zdarzenia molekularne wpływają na dysregulację monoamin.

Uzyskane dane możemy następnie odnieść do kontekstu wpływu na zachowanie. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ oznaczenie białka i fosforylacji wymaga wiedzy na temat ilości całkowitego białka niezbędnej do uzyskania dokładnego odczytu, co zależy od przeciwciał wybranych przez badacza. Kluczowe jest zatem wizualne zaprezentowanie tej metody.

Techniki sekcji oraz wyznaczanie średnich mono z białkami regulacyjnymi stanowią stosunkowo nowe podejście do analizy regulacji in vivo. Aby rozpocząć tę procedurę, schłodzić matrycę mózgu gryzonia, szalkę Petriego zawierającą pięć żyletek oraz skalpel nr 11 na warstwie mokrego lodu. Należy również wstępnie schłodzić na suchym lodzie tyle probówek, ile będzie potrzebnych do przeprowadzenia sekcji.

Następnie po uśmierceniu szczura należy wyjąć jego mózg i umieścić go odwróconym do góry dnem, tak aby boczna część móżdżku pasowała do wcięć w lodowatej matrycy. Po minucie należy wsunąć zimne żyletki w schłodzony mózg, zaczynając około 2 mm rostralnie od skrzyżowania wzrokowego w celu analizy prążkowia i jądra półleżącego. Następnie należy kontynuować wkładanie zimnych żyletek w każdym sekcji o szerokości 1 mm aż do połowy mostu; należy przy tym rozmieszczać żyletki w sposób przesunięty względem siebie, aby ułatwić ich późniejsze wyjęcie z matrycy.

Podczas wyciągania żyletek należy zlokalizować początek hipokampa, ponieważ stanowi on najlepszy punkt orientacyjny pozwalający upewnić się, że SN i VTA znajdują się w miejscu, w którym hipokamp całkowicie opasuje śródmózgowie. Wykonaj cięcia ostrzem skalpela nr 11, aby w pierwszej kolejności oddzielić SN od VTA. Usuń znajdującą się powyżej korę oraz hipokamp.

Następnie wykonaj cięcie pionowe oddzielające obszar pigmentowy SN od VTA, dbając o to, aby żyletka miała stały kontakt z mokrym lodem podczas sekcji. Dalej wykonaj cięcie poziome w linii środkowej lub w jej pobliżu, tuż nad grzbietową i najbardziej boczną częścią SN. Na koniec oddziel SN od reszty pnia mózgu.

Po usunięciu SN należy oddzielić VTA od pozostałej części śródmózgowia. Wypreparowane tkanki należy niezwłocznie umieścić w schłodzonych probówkach do wirówki. Następnie tkanki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu rozpoczęcia ich przetwarzania.

W tej procedurze, bezpośrednio po wyjęciu z suchego lodu, należy delikatnie zhomogenizować tkankę, używając lodowatego 0.1 molarnego roztworu kwasu nadchlorowego z EDTA. Następnie próbkę należy ponownie umieścić na suchym lodzie. W kolejnym kroku próbki należy odwirować z prędkością 12 000 RPM w celu osadzenia materiału.

Osad białkowy zostanie wykorzystany do oznaczeń metodą western blot; następnie odessajcie nadsącz do fiolki HPLC. Zamrożone osady białkowe powstałe w wyniku traktowania buforem HPLC umieśćcie na kruszonym lodzie w celu rozmrożenia i upewnijcie się, że cały bufor został usunięty i zarchiwizowany. W przypadku przetwarzania obustronnego SN do osadu dodajcie 300 µL 1%SDS zawierającego 5 mM Triss oraz 1 mM EDTA i poddajcie sonikacji, natomiast w przypadku przetwarzania obustronnego VTA wystarczy 200 µL 1%SDS.

Następnie umieść próbki w wrzącej wodzie na około pięć minut, aby dokończyć denaturację białek. Pozostaw je do ostygnięcia do temperatury pokojowej, upewniając się na tym etapie, że nakrętki są szczelnie zamknięte. Następnie wykonaj test BCA, stosując krzywą wzorcową białka w zakresie od 2 do 40 µg białka.

Aby określić stężenie białka w próbkach o objętości 5 µL, należy wykorzystać wartość mediany uzyskaną z analizy w trzech powtórzeniach, aby wyznaczyć ilość białka na podstawie krzywej wzorcowej. Wynik należy podzielić przez objętość próbki, aby obliczyć stężenie białka. Następnie, jeśli jest to konieczne (co zasygnalizuje kolor buforu), należy przygotować próbki z użyciem buforu do próbek zawierającego DIO three etol do redukującej elektroforezy SDS na żelu akryloamidowym 10%.

Zmienić kolor na żółty, dodając 1 M Tris base pH 8.2 do próbki w przyrostach 10 µL, aż pojawi się niebieski kolor. Aby zapewnić prawidłowe pH, należy przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE odpowiedniej ilości całkowitego białka na żelu z 10% akryloamidu, a następnie przenieść białka na membranę nitrocelulozową o rozmiarze porów 0,45 µm; ustawić komorę Hoffera na co najmniej 27 V i pozostawić transfer na noc.

Następnego dnia suszyć blot przez co najmniej 30 minut. Następnie barwić go roztworem Ponceau S przez około pięć minut. Po tym czasie intensywnie odbarwiać go 0,2% roztworem kwasu solnego, aż poszczególne prążki białkowe zostaną wyraźnie rozdzielone, a zabarwienie tła zostanie usunięte.

Następnie należy uzyskać obraz barwienia poncho S przy użyciu programu ImageJ, aby dalej określić ilościowo względne obciążenia białkiem w każdej ścieżce i znormalizować wyniki dla hydroksylazy tyrozynowej, transportera dopaminy lub pęcherzykowego transportera monoamin typu 2; tutaj przedstawiono western blot dla Ser31 phosphorylated tyrosine hydroxylase w próbkach prążkowia szczura. Skalibrowana krzywa wzorcowa dla Ser31 phosphorylated tyrosine hydroxylase obejmuje zakres od 0.3 ng do 2.0 ng i mieści się w liniowym zakresie detekcji. Tutaj przedstawiono western blot dla Ser40 phosphorylated tyrosine hydroxylase w próbkach brzusznejstycznej pola nakrywy szczura.

Skalibrowana krzywa wzorcowa dla fosforylowanej tyrozynohydroksylazy SN 40 mieści się w zakresie od 0,2 nanogramów do 1,5 nanogramów i znajduje się w liniowym zakresie detekcji. Ważne jest zachowanie odpowiedniej temperatury, a także prawidłowe oznakowanie probówek. Istotna jest również normalizacja białek w celu zmniejszenia wariancji otrzymanych wyników.

Niniejszy protokół, po dokładnym zastosowaniu, może dostarczyć badaczom z zakresu funkcji motorycznych i zachowań uzależnień szeroki zakres odczytów molekularnych dotyczących regulacji monoamin w mózgu, ze szczególnym uwzględnieniem dopaminy, która jest przedmiotem naszego zainteresowania. W rezultacie odczyty te mogą umożliwić bardzo szczegółową i wnikliwą analizę wpływu tych procesów na wyniki behawioralne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak zmaksymalizować odczyty regulacji monoamin w istocie czarnej oraz polu brzuszno-pokrywowym z jednej sekcji tkanki.