Wykorzystanie humanizowanych myszy BLT jako modelu nowotworowego w genoterapii opartej na komórkach macierzystych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie myszy posiadających zmodyfikowany ludzki układ odpornościowy. Osiąga się to poprzez przygotowanie myszy do zabiegu chirurgicznego, a następnie wprowadzenie fragmentu grasicy do trokara w drugim kroku. Matrigel miesza się z transdukowanymi komórkami CD 34 negatywnymi i CD 34 pozytywnymi, a następnie otrzymaną mieszaninę dodaje się do trokara.

Następnie konstrukty z matrigelu zostają przeszczepione pod torebkę nerki. Ostatecznie odrzucenie docelowych nowotworów przez genetycznie zmodyfikowane limfocyty T CD8 można monitorować za pomocą obrazowania PET na żywo oraz fizycznych pomiarów guza. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak modele całkowicie neuronowe, jest to, że metoda ta pozwala na badanie rozwoju genetycznie zmodyfikowanych ludzkich komórek macierzystych w ludzkim grasicy oraz późniejsze testowanie skuteczności in vivo pochodnych linii komórkowych; procedurę zaprezentuje trzech techników z naszych laboratoriów: Gregory Bristol, Bernard Levin i Sean Kim.

Na tym schemacie przedstawiono zmodyfikowany model BLT wykorzystany w niniejszych badaniach do generowania myszy chimerycznych niosących mart1+, specyficzne limfocyty T. Grasica jest rekonstruowana z transdukowanych i nietransdukowanych komórek CD34 wyizolowanych z autologicznej wątroby płodowej. Część transdukowanych komórek zostaje następnie zamrożona i wstrzyknięta napromieniowanym myszom po czterech do sześciu tygodniach.

W niniejszym filmie zaprezentowano implantację żywego konstruktu po tym, jak zwierzęta stały się powolne w wyniku działania anestezji. Należy rozpocząć od ogolenia lewej strony każdego myszy od biodra do barku, w obszarze między środkiem grzbietu a brzuchem. Po zapisaniu masy każdego zwierzęcia, należy ponumerować je poprzez przebicie uszu, a następnie podać podskórnie 0,3 mililitrów karprofenu w każdy z barków.

Następnie ułóż myszy na prawym boku, skierowane w lewą stronę. Teraz przepłucz trokar igły do implantacji nowotworów o rozmiarze 16 G z zaokrągloną końcówką za pomocą PBS. Używając pęsety półtechnicznej, umieść fragment grasicy w naczyniu z PBS, a następnie trzymaj trokar poziomo względem pręta.

Zasajguj tkankę tuż przy końcówce. Wsuniecie trokara pod torebkę nerkową i wstrzyknięcie tkanki jest jednym z najtrudniejszych etapów tej procedury. Następnie poproś o pomoc asystenta.

Użyj pipety wypierającej o końcówce typu eend orph, aby wymieszać 5 µL schłodzonego Matrigelu w probówce z komórkami, delikatnie mieszając zawiesinę. Trzymając trokar poziomo, powoli odciągaj pręt, podczas gdy pomocnik pipetuje Matrigel.

Wprowadź trokar dla każdej myszy. Najpierw przemyj odsłoniętą skórę zwierzęcia Betadyną, a następnie wytrzyj ją gazikiem nasączonym izopropanolem. Dwukrotnie zlokalizuj najciemniejszy punkt pod skórą, który wskazuje położenie śledziony.

Nerka znajduje się około pięciu milimetrów grzbieniowo w stosunku do śledziony; do uchwycenia skóry nad nerką należy użyć kleszczyków tępych. Wykonaj nacięcie skóry o długości około 15 milimetrów równolegle do śledziony. Wykonaj analogiczne nacięcie w warstwie mięśniowej otrzewnej poniżej.

U samców nerka powinna być bezpośrednio widoczna. Wystarczy ścisnąć brzuch, aby ją uwidocznić. U samic, utrzymując nacisk na brzuch lewą ręką w celu odsłonięcia nerki, należy najpierw użyć kleszczyków hemostatycznych do uchwycenia jajnika, a następnie wyciągnąć nerkę, aby pomóc w utrzymaniu narządu poza organizmem.

Wykonaj niewielki otwór w tylnej części torebki nerkowej, a następnie wsuń trokar do otworu i prowadź go wzdłuż nerki, aż otwór trokara zostanie całkowicie przykryty przez torebkę nerkową. Następnie, używając małego palca prawej ręki, wstrzyknij tkankę. Teraz za pomocą zamkniętej kleszczykowej hemostatyki delikatnie odsuń nerkę z powrotem na miejsce.

Zawieź jeden szew w otrzewnej podwójnym węzłem, ściągając skórę jak woreczek, a następnie zabezpiecz go dwoma klipsami do ran. Na koniec nanieś kroplę PBS na każde oko i połóż mysz na boku w klatce na ściółce. Po zaimplantowaniu wszystkich myszy w ten sam sposób, przed opuszczeniem zwierząt upewnij się, że wróciły do pozycji leżenia na brzuchu.

Ta pierwsza rycina przedstawia reprezentatywny obraz żywego implantu THI u myszy humanizowanych. Na tej rycinie zaprezentowano prawidłowy rozwój tkanki grasicy oraz fizjologiczną dystrybucję tkankową ludzkich limfocytów T CD4+ i CD8+. Po rekonstrukcji zwierzęta posiadają ludzki układ odpornościowy z prawidłowym rozkładem limfocytów T CD4+ i CD8+.

Kolejno przedstawiono reprezentacyjny obraz myszy z guzem czerniaka. Obszary szare wskazują obraz z tomografii komputerowej (CT). Obszary kolorowe wskazują aktywność metaboliczną guza wykrytą w badaniu PET.

Sama tomografia komputerowa (CT) w tym eksperymencie wskazała na dużą masę guza w obszarze zaznaczonym białym okręgiem. Jednakże, jak pokazuje obrazowanie PET in vivo, obszar ten składa się głównie z tkanki martwiczej i bliznowatej, co podkreśla użyteczność obrazowania PET jako bardziej czułej i dokładnej metody oceny regresji i eliminacji guza. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać inne analizy, takie jak fenotypowanie i aktywacja ex vivo limfocytów T, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące funkcji limfocytów T.