Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu
31 października 2012
Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest pozyskanie wielopotencjalnych komórek zrębowych z tkanki tłuszczowej w celu ich różnicowania osteogennego, z wykorzystaniem in vivo modelu defektu sklepienia czaszki u myszy. Cel ten realizuje się poprzez wstępną izolację komórek progenitorowych z warstwy naczyniowo-zrębowej tkanki tłuszczowej, którą można uzyskać po zabiegu liposukcji. Kolejnym krokiem jest przygotowanie trójwymiarowego stelaża, a następnie zasianie komórek na tym rusztowaniu.
Ostatnim krokiem jest utworzenie krytycznego defektu kalwarialnego w modelu szczura, w który wprowadzane są rusztowania i komórki. Ostatecznie wyniki wykazują, że multipotencjalne komórki zrębowe wyizolowane z tkanki tłuszczowej posiadają potencjał do regeneracji szkieletowej in vivo. Zastosowania tej techniki obejmują szerokie spektrum możliwych aplikacji klinicznych ze względu na niedobór tkanki dostępnej do regeneracji szkieletowej.
Choć autologiczne przeszczepy kostne stanowią złoty standard, brak miejsc pobrania oraz zachorowalność w miejscu pobrania ograniczają tę opcję. Można stosować allografty i materiały obce, lecz ich zastosowanie jest ograniczone przez koszty, słabą integrację oraz ryzyko infekcji.
Możliwość wykorzystania tkanki tłuszczowej do izolacji komórek progenitorowych w inżynierii tkanki szkieletowej jest niezwykle obiecująca. Procedurę zaprezentujemy ja oraz Michael Chung z laboratorium Long Anchor. W pierwszej kolejności należy pozyskać ludzką tkankę tłuszczową podskórną podczas planowych zabiegów liposukcji.
Należy zwrócić uwagę na dwie warstwy w aspiracie tłuszczowym. Nadpływ zawiera zdecydowaną większość materiału komórkowego z procesu. Dolna warstwa to głównie wstrzyknięta sól fizjologiczna.
Stromalne komórki pochodzące z tkanki tłuszczowej można pozyskać z którejkolwiek z warstw, jednak wydajność jest znacznie większa w przypadku nadsączu. Aby wyizolować frakcję naczyniowo-stromalną (SVF), należy wielokrotnie przemyć aspirat tłuszczowy równymi objętościami jednokrotnego roztworu soli fizjologicznej fosforanowej (PBS) zawierającego 2,5% Betadyny, a następnie zaspirować równą objętość 1x PBS bez Betadyny. Należy odstawić zawiesinę do osadzenia.
Należy przestrzegać zasad techniki sterylnej przez cały proces, aby uniknąć kontaminacji przetworzoną tkanką ludzką. Następnie odessać warstwę dolną i usunąć ją po każdym przemyciu, a następnie przenieść 15 mililitrów tkanki tłuszczowej do stożkowych probówek Falcon o pojemności 50 mililitrów. Następnie poddać tkankę tłuszczową trawieniu w 15 mililitrach filtrowanego roztworu 0,075%.
Dodaj kolagenazę typu dwa do zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) i inkubuj w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 60 minut przy stałym mieszaniu, pamiętając o wentylowaniu probówek co 15 minut. Następnie zneutralizuj aktywność enzymu, dodając 15 ml PBS zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), i odwiruj próbkę. W celu uzyskania gęstego osadu SVF należy pamiętać, że osad będzie stanowił mieszaninę mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzenia tłuszczowego oraz erytrocytów.
Najpierw usuń wierzchnią warstwę tłuszczu, a następnie odlej nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu. Resuspenduj osad w 10 mililitrach tradycyjnej pożywki wzrostowej. Następnie połącz zawartość trzech probówek w jednej czystej probówce stożkowej o pojemności 50 mililitrów, przepuszczając ciecz przez filtr 100 mikronów, a następnie odwiruj zawiesinę w wirówce.
Odlej nadsącz, nie naruszając osadu, a następnie go resuspenduj. W pięciu mililitrach tradycyjnego pożywki do hodowli połącz dwie probówki stożkowe o pojemności 50 ml na jedną płytkę 10 cm lub pięć probówek stożkowych o pojemności 5 ml na jedną płytkę 15 cm. Hodowle pierwotne inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C przy 21% tlenu i 5% dwutlenku węgla.
Po inkubacji przez noc wypłucz płytki buforem PBS, aby usunąć pozostałe, nieprzywierające erytrocyty. Otrzymane populacje komórek to komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej. Utrzymuj komórki na poziomach subkonfluencyjnych, aby zapobiec spontanicznej różnicowaniu.
W temperaturze 37 °C, przy 21% tlenu i 5% dwutlenku węgla. W pożywce wzrostowej komórki zazwyczaj wymagają pasażowania co trzy do czterech dni w standardowej pożywce wzrostowej. Po wysianiu do osiągnięcia 50% konfluencji, należy przygotować rusztowanie zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie.
Gdy komórki osiągną poziom subkonfluencji, przemyć je dwukrotnie PBS i poddać trypsynizacji. Policz komórki w celu ich kwantyfikacji. W celu wysiewu przygotuj rusztowania o średnicy 4 mm, na które należy wysiać 1,5 × 10⁵ komórek.
Umieść pojedynczy rusztowanie w jednej studience płytki 96-dołkowej, a następnie resuspenduj komórki w standardowej pożywce wzrostowej w stężeniu około 1,5 × 10⁵ komórek na 20 µL pożywki. Zasiej rusztowanie, pipetując 20 µL roztworu bezpośrednio na rusztowanie, a następnie umieść go w inkubatorze do hodowli komórkowych na 30 minut.
Po 30 minutach należy dodać 200 µL pożywki i inkubować komórki na rusztowaniu przez noc. Przed zabiegiem nie jest konieczne sprawdzanie adhezji komórek do rusztowania po wysiewaniu. Odpowiednia liczba komórek zapewni, że większość z nich przytwierdzi się do rusztowania.
Po znieczuleniu dorosłej, 60-dniowej myszy nagoj CD-1, trzykrotnie wysterylizuj miejsce operacyjne Betadyną i alkoholem, a następnie nałóż lubrykant na oczy myszy. Następnie wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej w płacie czołowo-ciemieniowym skóry głowy myszy, aby odsłonić prawą kość ciemieniową. Usuń okostną z prawej kości ciemieniowej poprzez delikatne skrobanie tępym narzędziem.
Następnie należy wykonać jednostronny defekt o grubości pełnej i średnicy czterech milimetrów w prawej kości ciemieniowej, poza obszarem szwów. Używając wiertła z diamentową powłoką, należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić leżącej poniżej opony twardej, ponieważ grubość czaszki myszy przed implantacją wynosi mniej niż 0,3 millimeters. Rusztowania należy przepłukać sterylnym PBS, aby zapobiec przeniesieniu czynników wzrostu pochodzących z pożywki.
Umieść rusztowanie w ubytku. Na koniec zaszyj skórę i monitoruj zwierzę zgodnie z ustalonymi protokołami pooperacyjnymi. Wykonaj mikro-tomografię komputerową (micro CT) myszy i uzyskaj obraz zrekonstruowany w 3D przy użyciu oprogramowania Microview.
Użyj programu Adobe Photoshop, aby dostosować obrazy do standardowej wysokości. Zazwyczaj pomiary regeneracji sklepienia czaszki wykonujemy co dwa tygodnie. Myszy są znieczulane podczas skanowania w ramach długoterminowej obserwacji, a na koniec poddawane eutanazji.
Do analizy histologicznej należy wykorzystać funkcję magicznej różdżki w celu pomiaru liczby pikseli w obrębie defektu kalwarialnego. Procentowe gojenie defektu należy określić na podstawie kolejnych skanów CT. Po zmierzeniu powierzchni defektu kalwarialnego, wyznaczeniu liczby pikseli i podzieleniu tej wartości przez liczbę pikseli w pierwotnym defekcie, należy zabarwić kilka przekrojów wzdłuż obszaru defektu, stosując barwniki histologiczne, takie jak błękit anilinowy i pen aro, aby wskazać formowanie się tkanki kostnej.
Użyj programu Adobe Photoshop, aby wyciąć wszystkie obszary znajdujące się poza ubytkiem w sklepieniu czaszki, a następnie użyj narzędzia magiczna różdżka, aby określić liczbę pikseli nowo powstałej kości w obszarze ubytku i porównaj wynik z grupami kontrolnymi lub innymi zmiennymi. Poniżej przedstawiono przegląd procesu pozyskiwania i aplikacji aspiratu tłuszczowego – od izolacji komórek macierzystych pochodzenia mezenchymalnego z tkanki tłuszczowej, przez ich ekspansję i różnicowanie, aż po zastosowanie in vitro oraz in vivo. Przedstawiono obraz z mikro-CT pokazujący gojenie in vivo ubytku w sklepieniu czaszki o rozmiarze krytycznym po zastosowaniu ASC w rusztowaniu z hydroksyapatytu, widoczne w dolnym rzędzie.
Kontrole, przedstawione w górnym rzędzie, obejmują grupę bez rusztowania oraz grupę z defektem. Środkowy rząd przedstawia defekt z umieszczeniem rusztowania bez komórek. Przedstawione tutaj LS to ilościowa ocena gojenia kostnego na podstawie mikro-CT, która wykazuje znacząco zwiększone gojenie w grupie A SC.
Jest to obraz histologiczny wykazujący zwiększoną osteogenezę w grupie A SC poprzez andal. Na niebiesko i pen barwienie AROM dla al. Na niebiesko osteoid barwi się na ciemnoniebiesko dla pen arom.
Przedstawione tutaj żółte barwienia osteoidu to ludzkie ASC oznakowane GFP, które zasiano na rusztowanie i pobrano po dwóch tygodniach. Barwienie wykonano z użyciem przeciwciała oznakowanego GFP, aby wykazać udział ludzkich komórek w regeneracji w obszarze defektu. Przedstawiono tutaj immunohistochemię przeciwko ludzkiemu antygenowi jądrowemu, wykazującą obecność ludzkich komórek w obszarze defektu po dwóch tygodniach.
Po opanowaniu techniki obróbka tkanki tłuszczowej może zostać przeprowadzona w ciągu czterech godzin, a zabieg chirurgiczny zajmuje około 10 minut na mysz. Należy pamiętać, że kość ciemieniowa jest zaokrąglona, podczas gdy wiertło jest płaskie, dlatego należy zachować ostrożność, aby przebić cały obwód czteromilimetrowego defektu. Pamiętaj, aby wiercić powoli, aby uniknąć uszkodzenia opony twardej mózgu.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat izolacji komórek progenitorowych z tkanki tłuszczowej. Należy wysiać te komórki na rusztowanie, a następnie wszczepić je myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje izolację komórek stromalnych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz utworzenie ubytku w sklepieniu czaszki o rozmiarze krytycznym wynoszącym 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu. Badanie wykazuje potencjał tych komórek do różnicowania osteogennego w modelu in vivo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Inżynieria tkankowa
- Medycyna regeneracyjna
Wstęp
- Stromalne komórki pochodzące z tkanki tłuszczowej są multipotencjalne i mogą różnicować się w różne typy komórek.
- Występuje niedobór tkanek dostępnych do regeneracji szkieletu.
- Defekty sklepienia czaszki są kluczowe dla badania regeneracji kości.
- Liposukcja stanowi źródło tkanki tłuszczowej do izolacji komórek.
Cel badania
- Wyizolowanie wielopotencjalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej.
- Ocena potencjału osteogennego tych komórek w modelu defektu sklepienia czaszki.
- Zbadanie zastosowań klinicznych w regeneracji układu szkieletowego.
Zastosowane metody
- Izolacja komórek progenitorowych z warstwy naczyniowo-stromalnej tkanki tłuszczowej.
- Przygotowanie trójwymiarowego rusztowania do zasiewu komórek.
- Utworzenie krytycznego defektu sklepienia czaszki w modelu mysim.
- Umieszczenie rusztowania i komórek w defekcie w celu oceny.
Główne wyniki
- Wielopotencjalne komórki stromalne wyizolowane z tkanki tłuszczowej wykazały potencjał w zakresie regeneracji szkieletu.
- Model in vivo wykazał skuteczną integrację komórek i rusztowania.
- Wyniki wskazują na obiecujące podejście do rozwiązania problemu niedoboru tkanek w regeneracji szkieletu.
- Potencjał do szerokich zastosowań klinicznych w medycynie regeneracyjnej.
Wnioski
- Komórki stromalne pochodzenia tłuszczowego mogą skutecznie przyczyniać się do regeneracji kości.
- Metoda ta stanowi odpowiednią alternatywę dla zastosowań w inżynierii tkankowej.
- Dalsze badania są niezbędne w celu optymalizacji technik pod kątem zastosowań klinicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Niniejszy protokół ustanawia model przedkliniczny do oceny terapii opartych na komórkach progenitorowych w regeneracji szkieletu, niwelując lukę translacyjną w inżynierii tkanki kostnej. Poprzez wykazanie potencjału osteogennego komórek zstrojowych pochodzenia tłuszczowego w modelu defektu o rozmiarze krytycznym, zapewnia on powtarzalny system ograniczania ryzyka dla kandydatów do terapii komórkowej przed badaniami umożliwiającymi złożenie wniosku IND. Podejście to wspiera priorytetyzację portfolio poprzez generowanie ilościowych danych dotyczących gojenia, które stanowią podstawę do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac w ramach programów rozwoju medycyny regeneracyjnej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie wielopotencyjności komórek zrębu oraz ich zdolności do różnicowania osteogenicznego w fizjologicznie istotnym modelu defektu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zstandaryzowany odczyt in vivo do oceny funkcjonalności komórek progenitorowych bez konieczności stosowania egzogennych czynników wzrostu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych punktów końcowych w badaniach mikro-CT oraz histologicznych w celu porównania konstruktów rusztowanie-komórka w zależności od źródła dawcy lub zmiennych procesu przetwarzania.
- Wartość operacyjna: Ustanawia odtwarzalny schemat postępowania w zakresie zasiewiania komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej na rusztowania hydroksyapatytowe, co wspiera standaryzację testów w badaniach przesiewowych przedklinicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje komórkową kostnienie w modelu z upośledzoną odpornością, co wspiera ekstrapolację do zastosowań u ludzi.
- Wartość operacyjna: Definiuje krytyczne parametry procesu, w tym dawkę komórek (1.5×10⁵ cells/scaffold), materiał rusztowania (HA-PLGA) oraz wielkość ubytku (4 mm), w celu zapewnienia skalowalności i transferu technologii.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywczego – od izolacji komórek progenitorowych po walidację przedkliniczną – umożliwiając iteracyjne doskonalenie kombinacji komórka-rusztowanie przed wyborem głównego kandydata.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących potencjału osteogennego komórek zialnych poprzez powiązanie ekspansji in vitro z naprawą defektów in vivo.
- Screening: Dostarcza gotowych do analizy systemów biologicznych z mierzalnymi wynikami (objętość w mikro-CT, barwienie histologiczne) do porównawczej oceny źródeł komórek lub modyfikacji rusztowań.
- Analityka: Zapewnia wyniki statystyczne, w tym redukcję powierzchni defektu oraz metryki osteoformowania oparte na pikselach, które umożliwiają porównania między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy pobieranie tkanki tłuszczowej z funkcjonalną regeneracją kości, ustanawiając ścieżkę ciągłości przedklinicznej w strategiach naprawy układu szkieletowego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia proces izolacji i zasiewania jako platformę wielokrotnego użytku do oceny wielu typów komórek progenitorowych lub wariantów biomateriałów w regeneracji kości.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Możliwość przewidywania potencjału osteogennego komórek progenitorowych, zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w procesie komórkowej regeneracji kości.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja izolacji frakcji naczyniowo-stromalnej, zasiewu rusztowań oraz tworzenia ubytków w różnych laboratoriach.
- Wartość strategiczna: Ulepszenie procesów decyzyjnych go/no-go w rozwoju terapii komórkowych, zmniejszenie ryzyka biologicznego w fazie rozwoju przedklinicznego.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja terapii komórkowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościową skuteczność gojenia w klinicznie istotnym modelu.
Kwestie wdrożeniowe
- Doświadczenie w przetwarzaniu tkanki tłuszczowej, sterylnej hodowli komórek oraz mysich technikach chirurgicznych.
- Instrumentarium do trawienia kolagenazą, wirowania, obrazowania micro-CT oraz analizy histologicznej.
- Standaryzacja protokołów izolacji SVF, metod kwantyfikacji komórek oraz przygotowania rusztowań pomiędzy zespołami.
- Kwestie adaptacyjne dla różnych źródeł tkanki tłuszczowej, gatunków lub modeli defektów, przy zachowaniu krytycznych parametrów wielkości.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność w wydajności komórek zrębu z lipoaspiratu oraz konieczność stosowania modeli z niedoborem odporności w celu zapobiegania odrzuceniu ksenoprzeszczepu.
