Kompaktowe kropki kwantowe do obrazowania pojedynczych cząsteczek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie fluorescencyjnych kropek kwantowych o zoptymalizowanej jasności i stabilności, a także zminimalizowanym rozmiarze i niespecyficznym wiązaniu, do zastosowania w obrazowaniu pojedynczych cząsteczek. Osiąga się to poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności małych rdzeni kropek kwantowych z selenku kadmu. Drugim krokiem jest stopowanie tych rdzeni z rtęcią w celu przesunięcia ich fluorescencji w stronę widma czerwonego oraz zwiększenia ich jasności.

Następnie na nanokryształach hoduje się cienką powłokę stopową w celu stabilizacji ich emisji fluorescencyjnej. Ostatnim etapem jest przeniesienie tych cząsteczek z rozpuszczalników organicznych do buforów wodnych przy użyciu polimeru wielokrotnego, który może zostać zmodyfikowany biologicznie obojętnym glikolem polietylenowym. W końcowej fazie wykorzystuje się spektrometrię fluorescencyjną, chromatografię żelową oraz elektroforezę żelową, aby wykazać, że cząsteczki te charakteryzują się silną fluorescencją, niewielkim rozmiarem hydrodynamicznym i neutralnym ładunkiem elektrostatycznym – cechami, które są odpowiednie do obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych cząsteczek w biologii.

Główną zaletą tych kropek kwantowych w porównaniu z istniejącymi materiałami komercyjnymi jest znacznie mniejszy rozmiar hydrodynamiczny tych nanocząstek. Chociaż mniejsze kropki kwantowe charakteryzują się mniejszą intensywnością fluorescencji, niższą stabilnością fluorescencji oraz emisją wyłącznie w spektrum niebieskim, zniwelowaliśmy te efekty, stosując proces wymiany kationów rtęci. Te nanokryształy mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biofizyki i sygnalizacji komórkowej, umożliwiając dynamiczne obrazowanie pojedynczych biomolekuł w zatłoczonych środowiskach biologicznych.

W celu rozpoczęcia należy przygotować 0,4 M roztwór selenu w top, dodając selen do kolby trójszyjnej o pojemności 50 ml, odsysając powietrze z kolby za pomocą wysokiej próżni i napełniając ją argonem za pomocą linii Schlenka w warunkach beztlenowych. Należy dodać 10 ml top i podgrzać do 100 °C przy mieszaniu przez jedną godzinę, aż do uzyskania klarownego, bezbarwnego roztworu.

Ostudzić roztwór do temperatury pokojowej i odstawić kolbę. Przygotować również roztwór tlenku kadmu, TDPA i ODE w kolbie trójszyjnej o pojemności 250 ml, stosując ilości podane w protokole pisemnym towarzyszącym temu filmowi. Odpowietrzyć roztwór za pomocą linii próżniowej podczas mieszania.

Zwiększyć temperaturę do 100 °C i odessać powietrze przez kolejne 15 minut. Aby usunąć zanieczyszczenia o niskiej temperaturze wrzenia w atmosferze argonu, podgrzać mieszaninę do 300 °C przez jedną godzinę, aby całkowicie rozpuścić tlenek kadmu. Roztwór zmieni kolor z czerwonawego na przejrzysty i bezbarwny; schłodzić roztwór do temperatury pokojowej.

Następnie dodaj HDA do roztworu kadru, podgrzej do 70 °C i odessij powietrze. Po osiągnięciu stałego ciśnienia zwiększ temperaturę i prowadź cofanie roztworu przez 30 minut. Przełącz zawór linii Schlenka na gaz obojętny i wprowadź termoparę bezpośrednio do roztworu.

W warunkach beztlenowych należy dodać DPP do roztworu kadmu i zwiększyć temperaturę do 310 °C. Następnie, używając jednorazowej plastikowej strzykawki z igłą o rozmiarze 16 G, należy pobrać 7,5 mL 0,4 M roztworu selenu. Po ustabilizowaniu temperatury na poziomie 310 °C, należy ustawić kontroler temperatury na 0 °C i szybko wstrzyknąć roztwór selenu bezpośrednio do roztworu kadmu.

Roztwór zmieni kolor z bezbarwnego na żółty, a następnie pomarańczowy, a temperatura szybko spadnie i ponownie wzrośnie do około 280 stopni Celsjusza. Najtrudniejszym krokiem w tej procedurze jest jak najszybsze wstrzyknięcie całej objętości strzykawki do roztworu kadmu. Zapewnia to jednorodną nukleację cząsteczek.

Po jednej minucie reakcji należy wyjąć kolbę z płaszcza grzewczego i szybko schłodzić strumieniem powietrza, aż temperatura spadnie poniżej 200 °C. Gdy temperatura osiągnie około 40 °C, roztwór należy rozcieńczyć 30 ml heksanu, co spowoduje wytrącenie większości pozostałego prekursora kadru. Osad ten należy usunąć poprzez wirowanie.

W sześciu 50 ml polipropylowych stożkowych probówkach wirówkowych rozcieńczyć 12 ml otrzymanego surowego roztworu nano Krystal. Po odwirowaniu przy zastosowaniu tych samych parametrów, ostrożnie zlać i usunąć nadsącz, dodając 40 ml acetonu. Następnie rozpuścić osad nano krysttal w heksanie.

Wykonaj ekstrakcję roztworu równą objętością metanolu, zachowując górną fazę. Powtórz tę ekstrakcję jeszcze dwukrotnie, aby przeprowadzić trzecią ekstrakcję. Objętość metanolu można dostosować do około 15 mililitrów, aby uzyskać skoncentrowany roztwór kropel kwantowych selenku kadmu w heksanie o stężeniu około 200 micromolar.

Typowa wydajność tej reakcji to trzy mikromolowe kryształy selenku kadmu o średnicy od dwóch do trzech nanometrów. Wyznacz średnicę i stężenie nanokryształów poprzez pomiar widma absorpcyjnego w zakresie ultrafioletu i światła widzialnego, zgodnie z opisem w procedurze pisemnej. Nanokryształy można częściowo wymienić na rtęć, aby przesunąć absorpcję i emisję fluorescencji w stronę czerwieni. W tym celu w szklanej fiolce o pojemności 20 mililitrów z mieszadłem zmieszaj heksan i chloroform, a następnie dodaj roztwór kropek kwantowych selenku kadmu w OLA oraz octan rtęci. Po oczyszczeniu nanokryształów i wyznaczeniu ich stężenia zgodnie z opisem w procedurze pisemnej, pozostaw nanokryształy na co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej w celu wzrostu otoczki.

Przygotować 0,1 M roztwory prekursorów powłoki w 50 ml kolbach trójszyjnych; w warunkach próżni podgrzewać roztwory prekursora kadru, prekursora cynku i prekursora siarki do temperatury wrzenia przez jedną godzinę w celu otrzymania klarownych roztworów, a następnie przenieść je do kolby trójszyjnej i napełnić argonem. Dodać TOPO, ODE oraz przygotowane kropki kwantowe selenku kadmu i rtęci. Odparować heksan w temperaturze pokojowej przy użyciu linii próżniowej.

Zwiększ temperaturę do 100 °C i prowadź reflux przez 15 minut. Przełącz zawór linii na gaz argonowy i wprowadź termoparę do roztworu nano-kryształów. Po zwiększeniu temperatury do 120 °C dodaj 0,5 monowarstwy lub 140 µL roztworu prekursora siarki i pozwól reakcji przebiegać przez 15 minut.

Zwiększ temperaturę do 140 °C. Dodaj 0,5 monowarstw lub 140 µL roztworu prekursora kadru i pozwól reakcji przebiegać przez 15 minut. Następnie dodaj 500 µL bezwodnego OLA do roztworu reakcyjnego.

W temperaturze 160 °C dodaj 0,5 monowarstwy, czyli 220 µL roztworu prekursora siarki, a następnie równą ilość roztworu prekursora cynku w temperaturze 170 °C, zachowując 15 minut odstępu między każdym dodaniem. Następnie w temperaturze 180 °C dodaj 0,25 monowarstwy, czyli 150 µL roztworu prekursora siarki oraz roztworu prekursora cynku w odstępach 15-minutowych. Schłodź roztwór do temperatury pokojowej i wyznacz nowy współczynnik ekstynkcji dla tych cząstek.

Wykorzystując widmo UV-vis i zakładając, że liczba nanokryształów nie uległa zmianie, należy przechowywać roztwór poreakcyjny jako mieszaninę nieoczyszczoną w zamrażarce. Na tym etapie nanokryształy można scharakteryzować za pomocą mikroskopii elektronowej, spektroskopii absorpcyjnej UV-vis oraz spektroskopii fluorescencyjnej. Do kolby trójszyjnej o pojemności 50 mililitrów należy dodać oczyszczone kropki kwantowe typu core-shell i usunąć heksan w wysokiej próżni.

Aby uzyskać suchy film, napełnić kolbę argonem. Dodać bezwodną purynę do filmu z nanocząsteczek i podgrzewać zawiesinę do 80 °C w ciągu jednej lub dwóch godzin. Nanocząsteczki ulegną całkowitemu rozpuszczeniu.

Do roztworu należy dodać 1 mL 1 FIO glicerolu i mieszać w temperaturze 80 °C przez dwie godziny. Po ochłodzeniu roztworu do temperatury pokojowej należy dodać 0,5 mL trietyloaminy w celu deprotonacji tioglicerolu i mieszać przez 30 minut. Po dodaniu trietyloaminy roztwór może stać się mętny ze względu na słabą rozpuszczalność polarnych nanokryształów w tej mieszaninie rozpuszczalników.

Przenieś roztwór kropek kwantowych do stożkowatej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej mieszaninę 20 ml heksanu i 20 ml acetonu, a następnie dokładnie wymieszaj. Wyizoluj wytrącone nanokryształy poprzez wirowanie, po czym przemyj osad acetonem, rozpuść osad z kropek kwantowych w pięciu ml DMSO w kąpieli ultradźwiękowej i ponownie poddaj wirowaniu. W ten sposób usuń ewentualne agregaty, a następnie wyznacz stężenie nanocząstek na podstawie widma absorpcyjnego UV-Vis.

Roztwór czystych kropek kwantowych należy wykorzystać w ciągu trzech godzin, ponieważ ich powierzchnia może powoli utleniać się w warunkach otoczenia w powietrzu. Rozcieńczyć roztwór kropek kwantowych do stężenia 10 µM lub mniej za pomocą DMSO i przenieść do kolby o pojemności 50 ml. Do roztworu kropek kwantowych, podczas mieszania, dodawać kroplami przygotowany roztwór rozcieńczonego kwasu poliakrylowego w DMSO o stężeniu 5 mg/ml, a następnie odgazować roztwór w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Przepłucz roztwór polimeru z kropkami kwantowymi argonem i podgrzewaj w temperaturze 80 °C przez 90 minut. Po ochłodzeniu roztworu do temperatury pokojowej dodaj kroplami równą objętość 50 mM octanu sodu o pH 8 i mieszaj przez 10 minut. Oczyść kropki kwantowe zgodnie z opisem w procedurze pisemnej i wyznacz stężenie na podstawie widma absorpcyjnego UV-vis. W szklanej fiolce o pojemności 4 mL z mieszadłem magnetycznym wymieszaj 1 mol kropek kwantowych w buforze boratowym z 40 000-krotnym nadmiałem molowym monoaminopolietylenoglikolu o masie 750 Dalton.

Instrukcje dotyczące dodawania specyficznych funkcjonalności chemicznych do nanokryształów znajdują się w pisemnej procedurze. Do roztworu kropek kwantowych szybko dodaj 25 000-krotną nadwyżkę molową świeżo przygotowanego roztworu czynnika aktywującego i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Powtórz ten krok jeszcze cztery razy, aby nasycić powierzchnię nanokryształów PEG.

Na koniec, aby przerwać reakcję, dodaj 200 µL 1 M buforu TRIS przed oczyszczeniem nanokryształów za pomocą wirnikowych filtrów do dializy lub ultrawirowania. Otrzymane nanokryształy można poddać analizie pod kątem monodyspersyjności, rozmiaru hydrodynamicznego i ładunku powierzchniowego, wykorzystując chromatografię cieczową, elektroforezę w żelu oraz mikroskopię fluorescencyjną. Przedstawione tutaj są reprezentatywne widma absorpcyjne i fluorescencyjne dla nanokryształów selenku kadmu, nanokryształów selenku rtęci i kadmu po wymianie kationowej oraz nanokryształów z rdzeniem z selenku rtęci i kadmu i powłoką z siarczku kadmu i cynku po wzroście powłoki. Nanokryształy z rdzeniem z selenku kadmu mają wydajność kwantową fluorescencji bliską 15%. Jednakże wydajność ta spada do poziomu poniżej 1% po wymianie rtęci, prawdopodobnie z powodu pułapek nośników ładunku wprowadzonych poprzez zaburzenia atomów powierzchniowych.

Wzrost cienkiej powłoki siarczku kadmu i cynku zwiększa tę wydajność do ponad 70%, co jest w dużej mierze utrzymywane po przeniesieniu do wody. W przeciwieństwie do nich, nanokryształy z rdzeniem z selenku kadmu i powłoką z siarczku kadmu i cynku, bez wbudowania rtęci, tracą znaczną część swojej wydajności kwantowej w wodzie, chyba że zostanie wyhodowana gruba powłoka. Należy zauważyć, że powlekanie siarczkiem kadmu i cynku przesuwa widma w stronę czerwieni ze względu na wyciek nośników ładunku elektronowego do materiału powłoki.

Przesunięcie to wynosi około 20 do 30 nanometrów dla rdzeni kadmowych i zwiększa się wraz ze wzrostem zawartości rtęci w rdzeniu. Dzięki wbudowaniu rtęci w nanokryształ rdzenia można zatem zachować niewielki rozmiar nanokryształu bez utraty jasności. Mały rozmiar został wykazany na tym mikrografie transmisyjnym oraz w rozkładzie wielkości cząstek nanokryształów z rdzeniem z selenku rtęci i kadmu oraz otoczką z siarczku kadmu i cynku, wykazując średnicę średnią 3,2 ± 0,6 nanometrów.

Zastosowanie dwuetapowego przeniesienia fazowego do wody jest kluczowe dla uzyskania homogennej populacji nanokryształów, które nie wymagają dalszego sortowania pod względem wielkości w celu usunięcia klastrów i agregatów za pomocą chromatografii wykluczania molekularnego. Przedstawiony tutaj chromatogram potwierdza, że wielkość jest zbliżona do wielkości konalbuminy. Przy 75 kilodaltonach i po modyfikacji aminowym PEG o masie 750 Daltonów, rozmiar zwiększa się do zaledwie 12 nanometrów, co jest zbliżone do wielkości przeciwciała IgG.

Modyfikacja PEG neutralizuje ładunek powierzchniowy, co potwierdzono w przedstawionym tutaj eksperymencie elektroforezy w żelu agarozowym; dołek zaznaczono strzałką, a polaryzację elektrod wskazano po prawej stronie, co pokazuje, że przed koniugacją nanokryształy migrują jako cząstki naładowane, natomiast nanokryształy pegylowane są neutralne elektrostatycznie. Przedstawiony tutaj mikrograf epifluorescencyjny ukazuje nanokryształy osadzone na szkiełku podstawkowym i wzbudzone widzialnym światłem o długości fali 545 nanometrów. Nanokryształy te są łatwo obserwowalne na poziomie pojedynczych cząsteczek przy 30 klatkach na sekundę przy użyciu kamery CCD z mnożeniem elektronów.

Wykres ten pokazuje, że liczba cząstek fluorescencyjnych obserwowanych w każdej klatce fluktuuje w czasie przy ciągłym wzbudzeniu. Jest to spowodowane kombinacją migotania oraz fotodegradacji. Przez pierwsze siedem minut dominuje migotanie, zanim powoli zacznie ujawniać się oksydacyjna fotodegradacja.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak chemicznie syntetyzować kropki kwantowe, jak przenosić je do buforów wodnych oraz jak modyfikować je na potrzeby zastosowań w obrazowaniu biologicznym. Proszę pamiętać, że praca z odczynnikami zawierającymi kadm i rtęć może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec ekspozycji personelu.