Symultaniczna elektroencefalografia, pomiar stężenia mleczanu w czasie rzeczywistym i optogenna manipulacja aktywnością neuronalną w korze mózgowej gryzoni

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar snu zdefiniowanego za pomocą EEG oraz stężenia mleczanu podczas stymulacji optogenetycznej w precyzyjnych współrzędnych stereotaktycznych. Chirurgicznie implantuj niezbędne wyprowadzenia elektroencefalograficzne oraz kaniule dla czujnika mleczanu i kabla światłowodowego. Następnie wprowadź kabel światłowodowy i uprzednio skalibrowany czujnik mleczanu do ich kaniul prowadzących w czaszce zwierzęcia.

Następnie dostosuj natężenie bodźca światła niebieskiego, aby uzyskać pożądaną odpowiedź elektrofizjologiczną. Następnie przejdź do zbierania danych z elektroencefalografii, elektromiografii oraz stężenia mleczanu, podczas gdy zwierzę może swobodnie przejawiać aktywność lub spać. W porównaniu z innymi metodami, takimi jak badania farmakologiczne EEG, to podejście eksperymentalne daje korzyść w postaci monitorowania biochemii mózgu i elektrofizjologii w czasie, gdy aktywność neuronów jest manipulowana w czasie rzeczywistym w skali poniżej sekundy.

Zatem potencjał do uzyskania nowych wglądów w dziedzinie badań nad snem jest wysoki. Można na przykład zidentyfikować metaboliczne i elektrofizjologiczne korelaty snu wolnofalowego. Ten rodzaj eksperymentu można zastosować również w innych obszarach neuronauki, takich jak uczenie się i pamięć, plastyczność synaptyczna czy zaburzenia napadowe.

Technika chirurgiczna ta jest wymagająca pod względem technicznym. Wymaga znacznej zręczności, którą można jednak wypracować poprzez praktykę. W tej demonstracji wizualnej omówię kluczowe etapy niektórych skomplikowanych procedur chirurgicznych, które będą uzupełnieniem opisu pisemnego.

Po powrocie zwierzęcia do stanu stabilnego po operacji wyzwaniem jest prawidłowe wprowadzenie czujnika mleczanów i kabla światłowodowego. Jonathan i ja zademonstrujemy, jak pewnie unieruchomić zwierzę, aby wprowadzić te dwa delikatne elementy wyposażenia. Na koniec pokażemy, jak zoptymalizować odpowiedź EEG poprzez dostosowanie intensywności bodźca w czasie rzeczywistym.

W tym eksperymencie należy użyć myszy transgenicznych wykazujących ekspresję kationowego kanału wrażliwego na światło niebieskie. Kanał ten jest obecny w neuronach kory mózgowej. Najpierw należy znieczulić mysz, stosując 5% isofluoranu i 95% tlenu do indukcji, a następnie podtrzymać znieczulenie za pomocą 3% isofluoranu i 97% tlenu.

Wykonaj cięcie pośrodkowe na szczycie czaszki, od miejsca między oczami do tyłu czaszki. Oczyść czaszkę nadtlenkiem wodoru i sterylną solą fizjologiczną. Zlokalizuj i zaznacz punkty Bregma i Lambda w celu wyznaczenia współrzędnych stereotaktycznych dla konfiguracji stymulacji optogenetycznej elektrod; wykonaj otwory prowadzące wiertarką stomatologiczną z wysokimi obrotami, używając najpierw wiertła kulistego o średnicy 0,5 mm, a następnie wiertła kulistego o średnicy 0,7 mm.

Wkręć śruby elektrodowe kelo gram w otwory za pomocą płaskiego śrubokręta ręcznego. Wkręcaj je przez około cztery do pięciu obrotów, aby uzyskać pożądaną głębokość. Przymocuj kaniule prowadzące za pomocą kaniuli stereotaktycznej, a następnie przytwierdź je do czaszki i kotwic za pomocą cementu akrylowego. Aby zachować drożność, każda kaniula prowadząca powinna zawierać kaniulę zastępczą lub stilet od momentu operacji do czasu rozpoczęcia eksperymentu.

Po umieszczeniu elektrod EEG i kaniul prowadzących w czaszce, należy przymocować je do siebie cienką warstwą akrylowego cementu stomatologicznego. Po utwardzeniu cementu należy umieścić złącze plastikowe nad wyschniętym kopcem cementu, przylutować końce przewodów wychodzących z elektrod EEG do styków we złączu plastikowym w przypadku, gdy przewody są zatopione w cemencie. Następnie należy wprowadzić przewody elektromiogramu do mięśni jądrowych, przesuwając je wewnątrz igły o rozmiarze 21G.

Przewierciwszy mięsień, zawiązać podwójny węzeł chirurgiczny przy użyciu nici nylonowej 5-0 wokół tych przewodów, tuż za miejscem ich wyjścia z mięśnia. Zaszyć rozsuniętą skórę, która została odsunięta w celu uzyskania dostępu do tkanki mięśniowej, stosując pojedyncze przerwane węzły chirurgiczne z użyciem igły P3 o odwróconym ostrzu i nici nylonowej 5-0. Po zaprogramowaniu jednostki stymulacji MC, uruchomić ją jako autonomiczny generator sygnałów w formie binarnego sygnału włącz/wyłącz o napięciu 5 V. Połączyć jednostkę stymulacji MC z jednostką zasilania laserem z funkcją TTL za pomocą złączy BNC.

Połącz jednostkę zasilania lasera z laserem za pomocą taśmy sygnałowej. Następnie podłącz laser do męskiego złącza FC znajdującego się na początkowym patchcordzie światłowodowym. Podłącz początkowy kabel światłowodowy do złącza obrotowego.

Kątowy przegub światłowodowy (komutator) służy jako komutator. Podczas gdy zwierzę porusza się w klatce, przegub obrotowy obraca się, aby zapobiec przerwaniu kabli światłowodowych pod wpływem momentu obrotowego. Za pomocą plastikowych opasek zaciskowych przymocuj komutator do metalnego statywu umieszczonego nad cylindryczną klatką, w której znajduje się zwierzę.

Unieruchom mysz, przytrzymując ją jedną ręką pod dłonią ułożoną w kształcie miseczki. Ustaw głowę myszy pomiędzy środkowym a wskazującym palcem eksperymentatora. Następnie oczyść kaniulę prowadzącą z zanieczyszczeń, używając sterylnej igły o rozmiarze 25 G.

Następnie ręcznie wprowadź światłowód i przymocuj go do kaniuli prowadzącej światłowód za pomocą gwintowanej nakrętki. Kontroluj głębokość wprowadzenia światłowodu do mózgu za pomocą węzła chirurgicznego zawiązanego na światłowodzie w stałej odległości od płaskiego, pociętego końca. Czujnik jest kalibrowany w roztworze soli fosforanowej i wystawiany na działanie trzech stężeń L-mleczanu w sposób stopniowy.

Zgodnie z protokołami producenta, wprowadź skalibrowany wcześniej czujnik do zamontowanej w czaszce kaniuli prowadzącej dla mleczanów w sposób identyczny z procedurą wprowadzania światłowodu. Podłącz czujnik mleczanów do przedwzmacniacza biosensora pinnacle 8, 400 za pomocą dwubiegunowych wtyczek. Następnie podłącz ten przedwzmacniacz do ośmiopinowego złącza w chirurgicznie wszczepionym uchwycie głowicowym.

Przed rozpoczęciem zbierania danych należy użyć pokrętła kontroli natężenia lasera, aby dostosować natężenie stymulacji optogenetycznej. Amplituda odpowiedzi EEG będzie różnić się pomiędzy zwierzętami ze względu na czynniki, które nie zostały systematycznie zbadane. Niezbędne jest zatem dostosowanie natężenia stymulacji optogenetycznej i zweryfikowanie, czy odpowiedź EEG jest odpowiednia po uzyskaniu pożądanego efektu.

Zbierz dane przy użyciu systemu Pinnacle 8, 400 z funkcją neuro score. Interfejs SEIA klasyfikuje stany snu poprzez wizualną analizę przetworzonych danych EEG i EMG. Dane w dziesięciosekundowych epokach klasyfikuje się jako czuwanie, sen bez szybkich ruchów gałek ocznych (non-REM) lub sen z szybkimi ruchami gałek ocznych (REM) na podstawie zapisu EEG i EMG.

Ta konfiguracja optogenetycznej stymulacji biosensora przedstawia chirurgicznie wszczepione elektrody EEG, czujnik mleczanów oraz kaniulę do stymulacji optogenetycznej. W przypadku braku stymulacji optogenetycznej mysz ta znajdowała się w stanie spontanicznego snu. Przejścia między stanami czuwania następowały podczas ciągłego monitorowania E-E-G-E-M-G oraz stężenia mleczanów w mózgu w stanie czuwania i dwóch podtypach snu.

Szybki ruch gałek ocznych (REM) oraz brak szybkiego ruchu gałek ocznych (non-REM) definiuje się na podstawie EEG i EMG. Co ciekawe, prąd biosensora mleczanowego wzrasta w funkcji EEG o niskiej amplitudzie i spada w funkcji EEG o wysokiej amplitudzie. Oba kanały EEG reagują na bodźce optogenetyczne dostarczane do kory przedczołowej.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat chirurgicznego implantowania myszy w celu jednoczesnej manipulacji optogenetycznej oraz pomiaru elektroencefalografii, elektromiografii i stężenia mleczanu w mózgu. Po opanowaniu techniki, zabieg chirurgiczny ten można przeprowadzić w ciągu 90 do 120 minut. Należy pamiętać o stałym monitorowaniu oddechu zwierzęcia jako wskaźnika głębokości znieczulenia.

Jeśli zwierzę oddycha rzadziej niż raz na cztery do pięciu sekund, znieczulenie może być zbyt głębokie. Jeśli zwierzę oddycha częściej niż raz na dwie sekundy, znieczulenie może być zbyt płytkie. Pamiętaj o zastosowaniu odpowiednich środków ostrożności podczas stosowania gazowego środka znieczulającego izofluranu.

Zapewnij odpowiednią wentylację w sali operacyjnej, aby chronić siatkówkę oka przed laserem używanym do stymulacji optogenetycznej. Należy założyć okulary ochronne lub umieścić zwierzę w szczelnej kabinie odpornej na światło. Zaleca się przećwiczenie implantacji biosensora mleczanowego oraz kabla światłowodowego na w pełni przebudzonej myszy.

Myszy nie poddają się tym procedurom i muszą być unieruchomione. Jednakże unieruchomienie nie może być na tyle silne, aby zranić zwierzę lub utrudnić oddychanie.