Aktywacja i ekspansja komórek Natural Killer T (NKT) za pośrednictwem sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC)

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC) opartych na CD 1D w celu ekspansji komórek NK T. Jest to realizowane poprzez najpierw dodanie białek w celu funkcjonalizacji kulek magnetycznych. W drugim kroku następuje wzbogacenie początkowej populacji komórek NK T z krwi obwodowej.

Następnie wzbogacone limfocyty T są hodowane wspólnie z A A PC. W ostatnim kroku ocenia się fenotyp i funkcję populacji komórek A A PC. Ostatecznie czystość namnożonych subpopulacji limfocytów T można określić za pomocą analizy cytometrycznej. Główną zaletą APC w porównaniu z obecnymi metodami wykorzystującymi komórki dendrytyczne jest fakt, że w przypadku komórek dendrytycznych może występować duża zmienność między dawcami.

Sztuczne komórki prezentujące antygen (APCs) zapewniają powtarzalną, standaryzowaną i gotową do użycia metodę ekspansji komórek NK T. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy pracowałem z dr Schneckiem i zespołem na Johns Hopkins. Byli oni pionierami w dziedzinie wykorzystania sztucznych kompleksów prezentujących antygen do ekspansji klasycznych podzbiorów limfocytów T CD8.

Procedurę zademonstrują dr James East, stażysta postdoctoralny, oraz syn dr Wendy, badacz współpracujący z mojego laboratorium. Należy rozpocząć od przeniesienia 1 mL kulek dyna bead M four 50 epoxy do 5 mL przezroczystej fiolki z gwintem wykonanej z borokrzemianowego szkła. Następnie należy wypłukać kulki 3 mL sterylnego buforu bore eight w oddzielnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.

Dodaj 100 µg ludzkiego dimeru CD 1D IG oraz 20 µg wybranych cząsteczek kostymulujących do 1 mL PBS pozbawionego wapnia i magnezu. Następnie umieść szklaną fiolkę zawierającą koraliki na magnesie i odessaj bufor boranowy. Po tym dodaj mieszaninę białek do fiolki i zakręć ją.

Natychmiast wymieszaj roztwór, odwracając fiolkę, następnie zabezpiecz korek parafilmem i pozostaw ją na rotatorze przez noc w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza. Następnego dnia ponownie umieść szklaną fiolkę na magnesie i ostrożnie usuń mieszaninę białek, unikając pobrania kulek. Przemyj kulki trzykrotnie, dodając trzy mililitrów buforu do mycia kulek i inkubując je na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza przez pięć minut.

Aby potwierdzić, że białka zostały stabilnie uniesione na kulkach, należy zabarwić alikwot kulek przeciwciałami i poddać je analizie cytometrycznej. Następnie przenieść 5 × 10⁷ kulek do małej szklanej fiolki o pojemności 1,5 ml i wypłukać kulki 1 ml sterylnego PBS. Przechowywać od 48 do 72 godzin przed użyciem.

Załaduj przemyte kulki antygenem w jednym mililitrze sterylnego PBS podczas procesu ładowania antygenu na kulki. Pobierz PBMC, najpierw rozcieńczając heparynowaną krew dawcy równą objętością PBS w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 15 mililitrów PHI w temperaturze pokojowej do stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów i powoli nanieś 25 mililitrów rozcieńczonej mieszaniny krwi na wierzch PHI.

Następnie odwiruj próbki przez 30 minut przy 700 ×g i temperaturze pokojowej z wyłączonym hamowaniem. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie przenieś warstwę limfocytów do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie przemyj limfocyty w 50 ml PBS, odrzuć nadsącz i połącz zawartość probówek pochodzących od jednego dawcy w jednej probówce.

Po ponownym przemyciu PBMC 20 mililitrami PBS, należy policzyć komórki, a następnie zawiesić je w buforze max w stężeniu 5 × 10⁷ komórek na mililitr. Aby wyizolować frakcję limfocytów T, należy inkubować 100 mikrolitrów roztworu do wzbogacania limfocytów T PAN z zestawu do wzbogacania ludzkich limfocytów T EP z dwoma mililitrami PBMC przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie roztwór należy inkubować z 100 mikrolitrami kulek magnetycznych w temperaturze pokojowej przez kolejne 10 minut.

Dopełnij objętość rozpuszczalnika do 2,5 milliliters, a następnie umieść probówkę w magnesie. Po pięciu minutach szybko przelej frakcję dodatnią CD3 do probówki stożkowej o pojemności 15 milliliters. Następnie przemyj komórki w pięciu milliliters zimnego buforu max i dokonaj zliczenia żywych komórek.

Pobierz alikwot do barwienia kontrolnego, aby w pierwszej kolejności wyselekcjonować komórki CD 1 61 dodatnie. Resuspenduj wzbogacone limfocyty T w 980 µL lodowatego buforu max, a następnie inkubuj komórki z 10 µg przeciwciała monoklonalnego anty-CD 1 61 przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po przemyciu komórek zresuspenduj osad w 800 µL buforu max i 200 µL mikro kulek anty-US IgG 1.

Inkubować ten roztwór w temperaturze 4°C przez kolejne 10 minut. Podczas inkubacji komórek z mikrokuleczkami, dodać 3 mL buforu MAX w celu równoważenia kolumny LS. Po przemyciu tej frakcji komórek, powoli pipetować komórki w 3 mL buforu MAX do kolumny.

Następnie wypłucz kolumnę trzykrotnie, używając po 3 ml świeżego buforu max. Następnie dodaj do kolumny kolejne 3 ml świeżego buforu max i przenieś kolumnę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wyciśnij oczyszczone komórki CD161+ CD3+ i oblicz liczbę komórek we frakcji wzbogaconej w komórki NKT.

Krok ten należy rozpocząć od kokultury 10⁶ wzbogaconych limfocytów T CD161+ CD3+ oraz 10⁶ allogenicznych komórek prezentujących antygen (aAPC) w 16 ml pożywki kompletnej. Następnie do płytki 96-dołkowej z polistyrenu o dnie w kształcie litery U, traktowanego do hodowli tkankowej i wyposażonej w pokrywkę ograniczającą parowanie, należy nanieść 160 µL kokultury na każdy dołek. W dniu 12–14 należy zebrać i przeliczyć komórki. Populacje należy przeanalizować za pomocą analizy cytometrycznej, a następnie ponownie poddać kokulturze.

Po przeprowadzeniu drugiej rundy ekspansji, nadmiarowe komórki NKT, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, należy zamrozić. Aby przetestować funkcjonalność komórek A APC, w pierwszej kolejności należy przeprowadzić kokulturę 5×10⁴ komórek NKT na studzienkę z 5×10⁵ komórek A APC w końcowej objętości 200 µL pożywki kompletnej w 96-dołkowej płytce z zaokrąglonym dnem. Po 24–48 godzinach należy zebrać nadsącz z hodowli komórkowej do analizy metodą ELISA. Pierwsza rycina pokazuje, że białka CD1D IG są stabilnie unieruchomione na powierzchni kulek magnetycznych, co przedstawiono tutaj.

Przeciwciała CD 1D IG oraz anty-CD 28 są wykazywane na powierzchni kulek magnetycznych, co przedstawiono na tym wykresie. Hybrynoma komórek NK T myszy DN 30 2D three, pozytywna pod kątem V alpha 14, była współhodowana z rozpuszczalnymi w medium A A PC nieobciążonym antygenem alpha-galactosyl, lub A A PC obciążonym alpha-gal. Następnie pobrano nadsącz z kultur i zmierzono produkcję IL two za pomocą metody ELISA, co stanowi prostą metodę testowania każdej partii komórek prezentujących antygen. W tym doświadczeniu ludzkie komórki T krwi obwodowej, pozytywne pod kątem CD 1 61 i CD three, zostały wzbogacone poprzez separację na kulkach magnetycznych.

Komórki stymulowano następnie raz w tygodniu przez 14 dni za pomocą A A PC obciążonego alpha galera, a następnie analizowano ekspresję V alpha 24 i V beta 11. Co istotne, stwierdzono, że nawet przy stosunkowo niskiej początkowej populacji komórek NKT wynoszącej 0,03%, możliwe było ich namnożenie do populacji w około 67% pozytywnej pod kątem V alpha 24 i V beta 11. W tym etapie komórki C one R CD 1D inkubowano z komórkami NKT w określonych proporcjach, w obecności lub nieobecności antygenu Alpha Gal SER, w 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U przez 20 do 24 godzin.

Lize komórek linii chłoniaka z komórek B pośredniczona przez komórki NKT oceniono następnie za pomocą testu uwalniania chromu. Komórki NKT rozszerzone w obecności PC były w stanie lizować tę linię komórek chłoniaka. W obecności lub przy braku alfa-galeractyny, komórki NKT zostały rozszerzone z PBMC zarówno zdrowych ochotników, jak i pacjentów onkologicznych, a następnie obciążone alfa-galeractyną.

W obu grupach udało się zwiększyć populacje komórek NKT. Przy zastosowaniu populacji wyjściowej składającej się z 2 milionów komórek T CD161+ CD3+, po dwóch rundach ekspansji można uzyskać ponad 10⁷ komórek. Ekspandowane komórki NKT mogą być wykorzystane do badań funkcjonalnych, co zostało tutaj zademonstrowane.

Komórki NKT rozszerzone ex vivo pozostają responsywne na stymulację Alpha GAL i są silnymi producentami IL 17 A, TNF alpha oraz interferonu gamma. Należy zauważyć, że jeśli początkowa populacja wzbogacona w limfocyty T jest niska i nie można przeprowadzić drugiego etapu wzbogacenia CD 1 61, ekspansja zapośredniczona przez A A PC może nie przynieść oczekiwanych rezultatów. Jeśli jednak odsetek krążących komórek NKT jest wyższy niż 0,1%, nadal powinno być możliwe uzyskanie znaczącej ekspansji niezmienniczych komórek NKT.

Łącznie dane te wykazują, że PC oparty na CD 1D może być skutecznie wykorzystywany do ekspansji i stymulacji pierwotnych ludzkich komórek NK T. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak QPCR, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące kinetyki aktywacji komórek NK T po ich namnożeniu. Technika ta toruje drogę badaczom z dziedziny hepatologii do zgłębienia roli komórek NKT w stłuszczeniowej chorobie wątroby.