Apetytywne warunkowanie węchowe u larw Drosophila

Celem niniejszej procedury jest analiza wyższych funkcji mózgu. W prostym modelu, u larw DFA, za pomocą apetytu oraz asocjacyjnego uczenia się węchowego. Jest to realizowane poprzez uprzednie zebranie 30 żerujących larw trzeciego stadium z probówki z pożywką.

Następnie larwy są trenowane przez pięć minut na szalce Petriego, gdzie jako nagroda służy fruktoza, a po obu stronach znajdują się pojemniki z zapachami, z których jeden zawiera octanal jako bodziec węchowy. Następnie przeprowadza się drugą, pięciominutową fazę treningu na szalce bez nagrody w postaci fruktozy, z pojemnikami zapachowymi po obu stronach zawierającymi octan amylu. Po trzech powtórzeniach obu faz treningowych larwy są poddane pięciominutowemu testowi bez nagrody, podczas którego po przeciwnych stronach znajdują się pojemniki z zapachami.

Ostatecznie, wzglólna preferencja zapachowa jednego octanu względem octanu amalu wskazuje, że larwy drozo-fili potrafią stworzyć skojarzenie między bodźcami węchowymi a nagrodą w postaci cukru, co może być wykorzystane do badania uczenia się asocjacyjnego w systemie genetycznie plastycznym. Metoda ta, w połączeniu z genetyczną interferencją funkcji neuronalnych, może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie uczenia się i pamięci, takie jak: które neurony sygnalizują nagrodę lub które neurony są niezbędne lub wystarczające do nabycia bądź przywołania powtarzalnego wspomnienia? Zademonstrowanie tej procedury będzie miało charakter anty-postoperacyjny.

Doktorant z mojego laboratorium najpierw przygotowuje szalki Petriego z 2,5% agarosem bez fruktozy. Aby przygotować szalki z fruktozą, należy dodać fruktozę do rozpuszczonej agarozy, a następnie wlać ją do szalek. Następnie należy oznaczyć każdą z tych szalek innym symbolem, aby zapewnić zaślepienie osoby przeprowadzającej eksperyment.

Naczynie zawierające fruktozę stanowi nagrodę warunkową, a naczynie puste jest kontrolą bez nagrody. Jako bodźce warunkowe należy przygotować łącznie trzy dostosowane pojemniki zapachowe z Teflonu, zawierające 10 µL czystego oktanolu. Pokrywki posiadają małe otwory, aby umożliwić odparowywanie zapachu.

Po drugie, przygotuj kolejne trzy pojemniki z zapachem, zawierające 10 µL octanu amylu rozcieńczonego w oleju parafinowym w stosunku 1:50. Rozcieńczenie to jest tak samo atrakcyjne jak 10 µL czystego octanu amylu, co przyciąga 30 osobników, które żerują, a nie błąkają się. Po trzecie, przenieś je z fiolki z pokarmem.

Protokół ten można przeprowadzać o dowolnej porze dnia. Jest on niezależny od rytmów okołodobowych. Przenieś larwy do szalki Petriego zawierającej kilka kropel wody z kranu i ostrożnie przesuwaj je pędzlem do przodu i do tyłu.

Następnie przenieś larwy do drugiej szalki Petriego, w której znajduje się kilka kropel wody z kranu. Sprawdź, czy na ścianach ciała larw znajduje się pasta pokarmowa. Teraz umieść szalkę Petriego w układzie eksperymentalnym, aby nauczyć larwy kojarzenia zapachów z konkretnym sygnałem cukrowym.

Umieść pojemnik z zapachem po lewej i prawej stronie jednej z dwóch użytych w bodźcach płytek. Tutaj zastosowano oktahedralną, lecz wybór jest dowolny, ponieważ eksperymentator nie zna rodzaju nagrody. Następnie umieść grupę larw w środkowej części płytki.

Zamknij pokrywkę i odczekaj pięć minut, podczas gdy zwierzęta są poddane działaniu bodźców. Upewnij się, że larwy mogą pokonać napięcie powierzchniowe kropli wody, aby nie zostały uwięzione i mogły swobodnie eksplorować. Umieść nowy pojemnik z octanem Amalu na świeżej płytce Petriego.

Po pięciu minutach, używając zwilżonego pędzelka, przenieś larwy do naczynia z przeciwnym typem bodźców umieszczonych po lewej i prawej stronie. W tym przypadku zapachem jest octan amylu. Po przeniesieniu larw zamknij pokrywkę i pozwól zwierzętom na eksplorację przez pięć minut.

Po upływie tego czasu pierwsza runda treningu zostaje zakończona. Przeprowadź dwie kolejne rundy treningu w ten sam sposób co pierwszą. Przenoś zwierzęta za pomocą wilgotnego pędzla, eksponując je na każdą kombinację bodźca i nagrody łącznie trzy razy.

W miejscu testu doświadczalnego należy umieścić świeże pojemniki z zapachami, po jednym z każdego bodźca, po przeciwnych stronach niepowlekanej szalki Petriego z agarozy. Przenieś wytrenowane zwierzęta na środek szalki. Zamknij pokrywkę i odczekaj pięć minut.

Po pięciu minutach, używając szablonu umieszczonego pod szalką, który wyraźnie wyznacza trzy strefy (lewą, prawą i środkową), należy policzyć liczbę larw w każdej z nich. Strefa środkowa jest traktowana jako wynik braku preferencji, co czyni analizę bardziej rygorystyczną i mniej podatną na błędy. Na koniec, aby zakończyć eksperyment, należy wybrać 30 nowych larw trzeciego stadium i powtórzyć proces uczenia i testowania z odwrotną kombinacją nagrody i bodźców.

Nadal należy używać tych samych pojemników z zapachami. Wymagane jest przeprowadzenie kilku testów kontrolnych, aby ustalić, czy zwierzęta transgeniczne wykazują prawidłowe przetwarzanie zapachów w odniesieniu do bodźców nagradzających. Test preferencji zapachowej u osobników naiwnych rozpoczyna się od zebrania i przemycia 30 larw w sposób analogiczny do procedury treningu i testowania.

Następnie przenieś larwy na szalkę Petriego z agaroza, zawierającą tylko jedną fiolkę z bodźcem po jednej stronie. Zamknij pokrywkę i odczekaj pięć minut. Następnie, korzystając z szablonu, oblicz liczbę larw znajdujących się po stronie bliższej, w środku oraz po stronie dalszej od bodźca.

Przeprowadź ten test dla każdego bodźca użytego w eksperymencie w celu zbadania preferencji cukrowej osobników naiwnych. Przygotuj połówkowe szalki Petriego, wycinając połowę agaru z jednej szalki i wypełniając pustą przestrzeń roztopionym agarem drugiego typu. Należy zadbać o to, aby obie połowy miały taką samą objętość i nie tworzyły wyraźnej krawędzi.

Może to wymagać ćwiczeń z wykorzystaniem przygotowanej w temperaturze pokojowej płytki typu half-half, umieszczonej 30 naiwnych osobników, oczyszczonych z pokarmu. Umieść larwy w stadium trzecim w centrum płytki. Zamknij pokrywkę i odczekaj pięć minut.

Następnie, korzystając z szablonu, należy policzyć liczbę larw po obu stronach oraz te znajdujące się w środku. Opisana procedura została wykorzystana do uczenia i testowania larw trenchgenic. Przy użyciu przykładowych bodźców dane zestawiono jako liczbę larw w różnych obszarach naczyń Petriego.

Po pięciu minutach poza tym preferowaniem danych obliczono indeksy, a wskaźniki wydajności wyprowadzono z grup trenowanych wzajemnie. Ponieważ badane larwy były transgeniczne, zaoferowano im wybór między wypełnionym pojemnikiem z zapachem a powietrzem, a także wybór między czystymi aromatami a aromatami z dodatkiem cukru. Analiza obliczonych indeksów na wykresie pudełkowym wykazała, że zwierzęta były w stanie nauczyć się rozróżniać jeden octan octanu od ML, wykorzystując aromaty fruktozy jako wzmocnienie apetytu.

Zwierzęta rozpoznały oba bodźce jako atraktanty i wykazały pierwotną preferencję zapachu fruktozy nad zapachem aero. Ten paradygmat eksperymentalny był z powodzeniem stosowany w przypadku szerokiej gamy bodźców węchowych i wizualnych, a także różnorodnych bodźców nagradzających i karzących. Paradygmat ten, w połączeniu z licznymi potężnymi manipulacjami genetycznymi dostępnymi u drosophila, jest szczególnie użyteczny w analizie sieci neuronowych; na przykład poprzez genetyczną manipulację specyficznymi zestawami neuronów, zdefiniowanymi przez wzorce ekspresji gal4, można ocenić funkcjonalną rolę tych neuronów w uczeniu się apetytu.

Niniejszą procedurę, wraz z genetyczną interferencją funkcji neuronalnych, można wykorzystać do analizy sieci neuronalnych w mózgu larwy zaangażowanych w procesy uczenia się i pamięci. Dzięki prostocie mózgu larwy możliwe jest osiągnięcie takiej precyzji analizy nawet na poziomie pojedynczej komórki.