Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja, charakterystyka i różnicowanie ludzkich mezenchymalnych macierzystych komórek miazgi zębów stałych z wykorzystaniem dwóch metod. Osiąga się to poprzez pobranie zdrowych, zatrzymanych zębów mądrości i ich początkowe przecięcie na poziomie połączenia cementu z szkliwem. Komórki macierzyste miazgi zębowej (D PSCs) są izolowane dwiema różnymi metodami.

W pierwszej metodzie tkanki polipów są trawione enzymatycznie poprzez inkubację w kolagenazie typu jeden z dodatkiem roztworu do przestrzeni dyskowej. Określamy je mianem ed. W przypadku metody izolacji w drugiej procedurze, tkanki polipów są jedynie umieszczane w kolbie, bez żadnego trawienia.

W ten sposób dpss zaczynają migrować z tkanki do kolby. Komórki te, nazwane OG, odnoszą się do metody izolacji poprzez przerost (outgrowth). Drugim krokiem procedury jest identyfikacja komórek macierzystych przy użyciu cytometrii przepływowej.

Trzecim krokiem procedury jest indukcja różnicowania odontoblastów, a ostatnim etapem jest porównawcza ocena różnicowania odontoblastów w dwóch grupach za pomocą barwienia Alizaryną czerwoną oraz qPCR. Jestem RA Kde z Katedry Komórek Macierzystych i Biologii Rozwojowej w Instytucie Rian. Dzisiaj zaprezentuję izolację, charakterystykę oraz porównawcze różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem dwóch metod.

Witam, jestem dr Rezaian z Instytutu Rio. Pracujemy nad projektem dotyczącym ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba. Komórki te są rodzajem mezenchymalnych komórek macierzystych, które można łatwo pozyskać przy minimalnym bólu i niskiej zachorowalności.

Mechy stem cells charakteryzują się plastycznością, zdolnością do tworzenia kolonii oraz potencjałem do wielokrotnej różnicowania. Dzień dobry, jestem dr Ami z Zakładu Komórek Macierzystych. W naszym instytucie stosujemy tę procedurę w laboratorium w celu izolacji komórek macierzystych na potrzeby badań naukowych oraz przyszłych zastosowań.

W medycynie regeneracyjnej pierwszym krokiem w wykorzystaniu tego źródła komórek macierzystych do przyszłych terapii opartych na tych komórkach jest wybór optymalnego protokołu izolacji komórek macierzystych z tkanki człowieka. Aby osiągnąć ten cel, kluczowe jest zbadanie określonych aspektów zachowania komórek w różnych warunkach izolacji. W pierwszej kolejności przeprowadzę izolację ludzkich komórek macierzystych z miazgi zęba, stosując albo dysocjację enzymatyczną miazgi, albo metodę wyprowadzania komórek macierzystych z implantów tkankowych.

Następnie należy je scharakteryzować i zróżnicować w blastocyty. Przejdźmy zatem do pracy. Najpierw odważamy i rozpuszczamy kolagenazę typu 1 w PBS.

Następnie przefiltruj je za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 µm. Przenieś obie próbki do probówki stożkowej. Następnie dodaj pener i PBS, aby uzyskać końcowe stężenie.

Przenieść zdrowe zęby mądrości do laboratorium w zimnej pożywce podstawowej w warunkach sterylnych. Przed rozpoczęciem badań oczyścić powierzchnię zęba 70% ethanolem. Należy upewnić się, że z powierzchni zęba usunięto wszelkie zanieczyszczenia.

Przetnij ząb w obręży połączenia cementowo- emulatego za pomocą wysterylizowanej tarczy dentystycznej, aby odsłonić komorę miazgi. Należy pamiętać, że proces cięcia musi być przeprowadzany powoli, aby ograniczyć przegrzanie tkanki zębowej. Następnie ostrożnie oddziel tkankę miazgi od korony, dzieląc ją na fragmenty o wielkości jednego do dwóch milimetrów za pomocą skalpela typu Scarpa.

Przenieś małe fragmenty tkanek miazgi do jednego mililitra roztworu enzymu na jedną godzinę w temperaturze 37 °C, mieszając na wortexie co 30 minut, aby wspomóc rozpad tkanek miazgi. Następnie usuń duże agregaty, przepuszczając je przez sito komórkowe o rozmiarze oczek 70 µm. Potem dodaj PBS zawierający PENER i wiruj przy 1 200 RPM przez pięć minut.

Ostrożnie usuń nadsącz. Następnie zawiesić płytkę w medium proliferacyjnym pm, przenieść ją do kolby hodowlanej i dodać medium. Następnie inkubować.

Wymieniaj pożywkę co trzy dni, aż do osiągnięcia odpowiedniej konfluencji komórek dla metody wyjściowej. Powtórz proces cięcia. Po przecięciu zęba oznacza to rozdrobnienie tkanek na fragmenty o wielkości od jednego do dwóch milimetrów.

Następnie umieść je w kulturze. Zalej medium do proliferacji i inkubuj. Należy pamiętać, że całkowita objętość medium do proliferacji musi zapewniać przytwierdzienie wszystkich fragmentów w celu dalszego wzrostu komórek.

Wymień medium po zaobserwowaniu wzrostu, a następnie powtarzaj tę czynność co trzy dni, aż do osiągnięcia konfluencji komórek. Do immunofenotypowania inkubuj oba typy D PSCs z przeciwciałami sprzężonymi z PE lub FITC przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Następnie dodaj PBS i wiruj przy 1 200 RPM przez pięć minut.

Usunąć supernatant, a następnie zawiesić komórki na płytce w PBS i w końcowej fazie ocenić markery powierzchniowe za pomocą cytometrii przepływowej; oba typy DPC poddać subkultywacji przez trzy pasaże. Następnie poddać działaniu trypsyny w lodzie i przenieść je do sześciu czerwonych naczyń hodowlanych przy 60% zlewnej (confluency), zastępując PM medium odontogennym. Trzy studzienki pozostawić jako kontrolę negatywną poprzez dodanie PM.

Wymieniaj pożywkę co trzy dni; w 21. dniu wypłucz komórki za pomocą PBS. Następnie utrwal je, dodając jeden mililitr 10% formaldehydu na studzienkę, inkubując przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Po 15 minutach ostrożnie usunąć utrwalacz i trzykrotnie przemyć komórki wodą destylowaną. Następnie zastąpić wodę jednym mililitrem roztworu barwiącego alza na czerwono. Po 20 minutach usunąć nadmiar barwnika i czterokrotnie przemyć komórki wodą dejonizowaną.

Następnie do każdego dołka dodaj 1 ml wody, aby zapobiec wysychaniu komórek. Po barwieniu, pod mikroskopem można zaobserwować, że trzy górne rzędy przybrały czerwony kolor w porównaniu z kontrolami; przy dużym powiększeniu widoczna jest absorpcja barwnika wokół komórek, co umożliwia ilościowe oznaczenie czerwonego barwienia. Po usunięciu wody dodaj do każdego dołka 1 ml 10% kwasu octowego, a następnie inkubuj przez 30 minut przy potrząsaniu.

Następnie delikatnie zeskrob komórki z płytki za pomocą skrobaka do komórek. Następnie przenieś je do osobnych probówek. Wiruj intensywnie przez 30 sekund.

Następnie podgrzać je do 85 °C przez 10 minut. Aby zapobiec odparowaniu, zamknąć probówki za pomocą Parafilmu i przenieść na lód na pięć minut, a następnie odwirować z prędkością 20 000 ×g przez 15 minut. W międzyczasie przygotować seryjne rozcieńczenia wzorca Alizarin Red zgodnie z protokołem regionalnym.

Po wirowaniu zdejmij znadfiltr i przenieś go do nowych probówek. Zneutralizuj pH za pomocą 10% wodorotlenku amonu. Następnie dodaj standardy oraz próbki do płytki 96-dołkowej.

Przenieś próbki do płytki do mikrotytrowania, następnie zmierz absorbancję przy 405 nanometrach i przeanalizuj dane zgodnie ze standardowym rozcieńczeniem seryjnym. Tutaj widoczne są dPSC, które zostały wyizolowane poprzez dysocjację enzymatyczną w 10., 15. i 18. dniu, a także dPSC z hodowli wtórnej w 5., 10., 13. i 18. dniu. Oba typy dPSC w fazie trzeciej mają niemal taki sam rozmiar i morfologię. Wyniki immunofenotypowania wykazują obecność markerów mezenchymalnych komórek macierzystych, takich jak CD 44, CD 73 i CD 19, oraz brak markerów hematopoetycznych i śródbłonkowych, takich jak CD 34, CD 45 i CD 11 B. Co ciekawe, ekspresja CD 105 i CD 146 jest wyższa w dPSC z hodowli wtórnej w porównaniu do D-P-S-C-E-D; ilościowa analiza barwienia Alizaryną czerwoną w 21. dniu różnicowania odontoblastów wykazuje większe odkładanie wapnia w D-P-S-C-E-D w porównaniu z dPSC bez zastosowania kon-dental top.

Wyniki qPCR wskazują również na znacznie wyższą ekspresję MEP oraz ALP jako markerów mineralizacji w komórkach D-P-S-C-D w porównaniu z wyjściowymi komórkami macierzystymi zębów. Jednocześnie oba geny są regulowane podczas różnicowania, a ekspresja DSPP jako markera odontogennego wzrosła w trakcie tego procesu. Niemniej jednak, w zróżnicowanych komórkach nie stwierdzono istotnych różnic w ekspresji DSVP pomiędzy grupami ED i OG.

Właśnie pokazaliśmy, jak izolować ludzkie komórki macierzyste z tkanek zęba, wykorzystując albo enzymatyczną dysocjację miazgi, albo wzrost komórek macierzystych z eksplantu tkankowego. To już wszystko. Życzymy powodzenia w zastosowaniu tej procedury w Państwa eksperymentach.

Dziękujemy.