Analiza fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE z wykorzystaniem enzymatycznego testu fuzji komórek

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie zdarzeń fuzji komórkowej opśredniczonej przez białka SNARE poprzez aktywowaną ekspresję beta-galaktozydazy. Osiąga się to poprzez uprzednią ektopową ekspresję białek v-SNARE i t-SNARE na powierzchni komórek cos-7. Kolejnym krokiem procedury jest połączenie komórek wykazujących ekspresję białek v-SNARE z komórkami wykazującymi ekspresję białek t-SNARE.

Prowadzi to do pośredniczonej przez białka SNARE fuzji komórek i aktywowanej ekspresji beta-galaktozydazy. Ostatecznie aktywność beta-galaktozydazy indukowaną fuzją komórek mierzy się za pomocą spektrofotometru. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopowy test regionu SAL, jest możliwość analizy wielu kombinacji białek SNARE.

Ilościowo, choć metoda ta może zostać zastosowana do zrozumienia mechanizmu i regulacji fuzji błon pośredniczonej przez białka SNARE, może ona również służyć do prowadzenia badań wysokoprzepustowych. Procedurę zademonstrują dr Na Hassan, pracownik post-doc oraz David Humphrey, technik z mojego laboratorium, w dniu poprzedzającym obciążenie transfekcyjne.

Płytki 24-dołkowe z szklanymi zakryciami o średnicy 12 mm; przygotuj dwa dołki dla każdej kombinacji komórek wykazujących ekspresję unikalnych plazmidów w eksperymencie na tych zakryciach. Wysiej 30 000 komórek COST7 hodowanych w DMEM uzupełnionym o 4,5 g/l glukozy oraz 10% FBS do transfekcji. Do każdego dołka dodaj 0,25 µg plazmidu TTA oraz jeden zestaw plazmidów ekspresyjnych.

Odwrócone białka zainteresowania, w tym przypadku odwrócone białka vamps, aby przetransformować limfocyty T, dodajemy jedną czwartą mikrograma plazmidu kodującego TRE lacks Z oraz uzupełniający zestaw plazmidów kodujących odwrócone białka zainteresowania. W tym przypadku są to snap 25, syntaxina 1 oraz syntaxina 4. Następnie transformujemy cost 7 za pomocą lipfekcji zgodnie z instrukcją producenta i hodujemy komórki przez 24 godziny. 24 godziny po transformacji utrwalamy komórki w suplementowanym parafomaldehydzie przez 10 minut. Po utrwaleniu płuczemy komórki trzykrotnie w PBS++, a następnie blokujemy komórki w suplementowanym FBS przez 30 minut.

Po blokowaniu inkubuj komórki z przeciwciałem monoklonalnym anty-mic Nine E 10 przez 30 minut. Po czterokrotnym przemyciu PBS++ inkubuj komórki przez godzinę z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z FITC w rozcieńczeniu 1:500. Po kolejnych czterech przemyciach PBS++ zamontuj znakowane komórki w dostępnym komercyjnie medium anty-fade.

Komórki są teraz gotowe do mikroskopii konfokalnej. Dzień przed transfekcją wysiać 1,2 miliona komórek Cos-7 do każdej 100-milimetrowej płytki do hodowli tkanek oraz 200 000 komórek Cos-7 do każdej studzienki płytek 6-dołkowych dla każdej analizowanej kombinacji plazmidów. Przygotować jedną studzienkę kontrolną. Hodować komórki przez 24 godziny. Następnego dnia dodać plazmidy do transfekcji; w przypadku komórek Cos-7 do komórek w każdej 100-milimetrowej hodowli wprowadzić plazmid wykazujący ekspresję białka zainteresowania z fuzją FLIP oraz 5 µg pTet-Off.

W 100 mm naczyniu hodowlanym przeprowadź kotransfekcję komórek kontrolnych za pomocą pustego wektora oraz P te off w tych samych stężeniach względnych co w komórkach V. Po dodaniu wszystkich plazmidów do komórek V i komórek kontrolnych, dodaj tcom mycin do tych studni, aby zapobiec N-glikozylacji vamps. W każdej studni płytek sześcio-dołkowych przeprowadź kotransfekcję komórek T za pomocą 1 µg PBIG z komplementarnymi plazmidami wykazującymi ekspresję białek zainteresowania.

Następnie przeprowadź transfekcję komórek Cost7 za pomocą lipofektaminy zgodnie z instrukcją producenta. Hoduj komórki przez 24 godziny. Po 24 godzinach od transfekcji odklej komórki V z naczyń hodowlanych, używając bezenzymowego buforu do dysocjacji komórek. Rozpocznij od jednorazowego przemycia komórek 20 ml PBS.

Następnie należy dodać 5 mL buforu dysocjującego wolnego od enzymów. Po 10 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej komórki zostaną uwolnione poprzez energiczne opukanie płytki; należy sprawdzić pod mikroskopem, czy odłączyły się one od podłoża. Jeśli odłączyło się mniej niż połowa komórek, należy odczekać kolejne 5 minut i ponownie opukać płytkę.

Kontynuuj inkubację w buforze odrywającym, aż odłączy się ponad połowa komórek. Następnie policz komórki V za pomocą cytometru hematologicznego. Potem resuspenduj komórki V do stężenia około 480 000 komórek na mililitr w uzupełnionym buforze DMEM.

Następnie dodaj jeden mililitr resuspendTimeowanych komórek V do każdej studni zawierającej komórki T i wprowadź płytki z powrotem do inkubatora. Po sześciu, 12 lub 24 godzinach współhodowli komórek przemyj je roztworem PBS i dodaj bufor do lizy. Następnie zeskrob komórki ze studni i przenieś je do probówek w celu odwirowania.

Po wirowaniu przenieś nadsącz do nowej probówki i zmierz ekspresję beta-galaktozydamidazy za pomocą dostępnego komercyjnie testu zgodnie z instrukcjami producenta; podczas realizacji protokołu należy pamiętać o zatrzymaniu reakcji kolorymetrycznej po 90 minutach poprzez dodanie jednomolowego węglanu sodu w celu oceny wyników. Zmierz absorbancję przy 420 nm za pomocą spektrofotometru. Gdy komórki CO7 zostały transfektowane plazmidami flipped snare, białka flipped snare uległy ekspresji na powierzchni komórek.

Do pomiaru poziomów ekspresji białek SNARE na powierzchni komórek wykorzystano cytometrię przepływową. Aby porównać ich zdolności do fuzji błon, białka VAMP muszą być eksponowane na tym samym poziomie. W związku z tym stężenie każdego z odwróconych plazmidów SNARE użytych do transfekcji zostało poddane miareczkowaniu i zoptymalizowane pod kątem procesu transfekcji.

W takich warunkach białka vamp 1, 3, 4, 5, 7 i 8 oraz syntaxin 1 i 4 były wyrażane na tym samym poziomie odpowiednio na powierzchni komórek; neuronalne białka SNARE pośredniczące w egzocytozie synaptycznej zostały wykorzystane do przetestowania wykonalności analizy. Rzeczywiście, po połączeniu komórek V wyrażających vamp 2 i komórek T wyrażających SYNTAXIN 1 oraz snap 25, wykryto silną ekspresję beta-galaktozydazy. Jednakże, gdy vamp 2 lub SNAP 25 nie były wyrażane, wykryto jedynie podstawową aktywność beta-galaktozydazy, co wskazuje, że fuzja komórek i ekspresja beta-galaktozydazy zależą od oddziaływań białek v-SNARE i t-SNARE; ogólnie SYNTAXIN 1, snap 25, vamp 1, vamp 3 i vamp 8 wykazały porównywalną i najwyższą aktywność fuzyjną.

W przeciwieństwie do tego, bazowa aktywność beta GAL sugeruje, że kombinacja białek nie indukuje fuzji błon, co ma miejsce w przypadku vamp five i SYNTAXIN one. Snap 25. Podczas przeprowadzania enzymatycznego testu fuzji ważne jest, aby pamiętać o dodaniu unikamycyny w celu zapobiegania glikozylacji białek esna oraz dodaniu DTT, aby zapobiec tworzeniu się wiązań dwusiarczkowych między białkami esna.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić test fuzji komórek.