Przygotowanie i inaktywacja patogenów w koncentratach płytek krwi z podwójnej dawki warstwy leukocytowej z wykorzystaniem systemu INTERCEPT Blood System

W tym filmie przygotowany zostanie koncentrat płytek krwi w podwójnej dawce z puli siedmiu warstw buforowych (buffy coats), a następnie zostanie on poddany działaniu preparatu Intercept. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak wytworzyć inaktywowany patogenowo koncentrat płytek krwi w podwójnej dawce. W pierwszej kolejności przedstawiamy schematyczny przegląd, po którym następuje demonstracja.

Pierwsze siedem jednostek donowanej krwi pełnej poddaje się wirowaniu i separacji, aby uzyskać siedem jednostek warstwy leukocytowej (buffy coat), które spełniają wymagania dotyczące objętości i hematokrytu. Warstwy leukocytowe są łączone w jedną pulę i wirowane. Następnie zawiesina płytek krwi jest oddzielana od pozostałych erytrocytów w celu otrzymania podwójnej dawki koncentratu płytek krwi do inaktywacji patogenów i leukocytów.

Koncentrat płytek krwi w podwójnej dawce jest przetwarzany przy użyciu systemu Intercept, który sieciuje kwasy nukleinowe. Ostatecznie procedura ta pozwala na uzyskanie dwóch terapeutycznych dawek płytek o akceptowalnej jakości in vitro przez siedem dni przechowywania, co potwierdzono poprzez pomiar pH, glukozy, mleczanu, PO2 i PCO2 oraz testy stabilności. Technik z mojego centrum krwiodawstwa zaprezentuje tę procedurę, a my opiszemy wymagania dotyczące przetwarzania.

Najpierw należy upewnić się, że podwójna dawka koncentratu krążka płytek krwi spełnia specyfikacje przetwarzania przeplotowego: objętość od 300 do 420 mililitrów, dawka płytek od 2,5 do 7 × 10¹¹ oraz liczba erytrocytów poniżej 4 × 10⁶ na mililitr. Rozpocznij tę procedurę, wykorzystując siedem jednostek krwi pełnej pobranych do zestawów do pobierania o pojemności 450 mililitrów.

Umieść jednostki krwi w naczyniach do wirowania i wykonaj wirowanie o wysokiej prędkości przy 4 880 RCF przez 11 minut w temperaturze pokojowej z ustawieniem hamowania B5 zgodnie z instrukcjami producenta. Po wirowaniu krew zostanie rozdzielona na trzy warstwy: erytrocyty, warstwę leukocytarną (buffy coat) oraz osocze. Przelej osocze do górnego worka satelitarnego, a erytrocyty do dolnego worka satelitarnego, pozostawiając warstwę leukocytarną o objętości około 48 ml i hematokrycie 37% w pojemniku do pobierania.

Umieść warstwy leukocytarne (buffy coats) w temperaturze pokojowej na agitatorze do płytek krwi przez noc; sterylnie połącz siedem warstw leukocytarnych oraz 300 mililitrów SSP z roztworem dodatkowym do płytek krwi. W konfiguracji drenującej, z roztworem dodatkowym na górze, zaklemuj linię pomiędzy roztworem dodatkowym a pierwszą warstwą leukocytarną, jak pokazano tutaj. Otwórz zgrzewy pomiędzy jednostkami warstw leukocytarnych i pozwól im spłynąć do ostatniego pojemnika z warstwą leukocytarną.

Następnie otwórz zacisk oraz zgrzew pomiędzy roztworem dodatku a pierwszą warstwą leukocytarną i pozwól, aby około jednej trzeciej roztworu dodatku (około 100 ml) przepłukała kolejno każdy z pojemników z warstwą leukocytarną przed zamknięciem zacisku; powtórz płukanie jeszcze dwa razy, za każdym razem używając około 100 ml roztworu dodatku. Odłącz pojemnik z połączoną warstwą leukocytarną od pustych pojemników. Objętość połączonej warstwy leukocytarnej, wliczając roztwór dodatku, powinna wynosić około 600 ml.

Umieść połączone warstwy leukocytarne (buffy coats) na mieszadle na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie podłącz pojemnik do przechowywania płytek krwi z zintegrowanym filtrem do redukcji leukocytów do worka zawierającego pulę warstw leukocytarnych. Umieść połączone warstwy leukocytarne oraz pojemnik do przechowywania płytek krwi w wirówce i wiruj przy 462 RCF przez dziewięć minut i 20 sekund.

Po wirowaniu przelać zawiesinę płytek przez filtr redukcyjny Luca do pojemnika do przechowywania płytek. Wynikiem jest podwójna dawka koncentratu płytek zawierająca około 7×10¹¹ płytek w 420 ml, która może zostać poddana inaktywacji patogenów za pomocą systemu Intercept. Podwójną dawkę koncentratu płytek przetwarza się przy użyciu zestawu procesowego Intercept, który składa się z pojemnika do antykoagulanta, pojemnika do naświetlania oraz podwójnych pojemników do przechowywania.

Podłącz pojemnik z zawiesiną płytek krwi do pojemnika z aminem w zestawie do przetwarzania przechwytu. Następnie zawieś płytki. Przełam dolną kaniulę w pojemniku z aminem, aby umożliwić przepływ roztworu do pojemnika do iluminacji.

Następnie przełam górną kaniulę w pojemniku z Aminem, aby płytki krwi mogły przepłynąć przez pojemnik z Aminem do pojemnika do iluminacji. Delikatnie wymieszaj mieszaninę płytek krwi i amtosyny. Lekko ściśnij pojemnik do iluminacji, aby usunąć z niego powietrze.

Uszczelnij rurkę pomiędzy pojemnikiem do iluminacji a pojemnikiem amato w taki sposób, aby z pojemnika do iluminacji wystawało nie więcej niż cztery centymetry rurki. Usuń i wyrzuć puste pojemniki. Umieść zestaw do przetwarzania w iluminatorze, umieszczając pojemnik do iluminacji w dużym przedziale po lewej stronie, a organizer w mniejszym przedziale po prawej stronie.

Zeskanuj identyfikator donacji. Kod produktu i przetwarzanie. Wprowadź numer partii do iluminatora.

Zamknij metalową pokrywę oraz szufladę. Naciśnij start, aby rozpocząć naświetlanie. Iluminator dostarcza kontrolowaną dawkę światła UVA do mieszaniny płytek krwi i amin w pojemniku do naświetlania.

Amina wiążą się pomiędzy parami zasad kwasów nukleinowych patogenów, które mogą znajdować się w jednostce platelets. Po naświetleniu powstają trwałe wiązania sieciowe, które blokują DNA lub RNA, w wyniku czego patogeny nie mogą się już replikować ani wywoływać choroby u biorcy produktu krwi. Po naświetleniu należy usunąć zestaw do przetwarzania.

Następnie wyjmij pojemniki z organizera, a płytki i zestaw do przetwarzania zawieś. Odłam kaniulę przy wylocie pojemnika oświetlającego i pozwól płytkom wpłynąć do pojemnika CAD. Wewnątrz pojemnika CAD znajduje się wafel z unieruchomionymi makroporowatymi kuleczkami polistyrenowymi, które redukują poziom resztkowej amoniaku w produkcie krwi.

Należy uważać, aby nie wygiąć płytki CAD. Wypchnąć powietrze z pojemnika CAD do pojemnika z oświetleniem. Uszczelnić rurkę w pobliżu otworu wlotowego pojemnika CAD.

Zdjąć i wyrzucić pusty pojemnik do oświetlania. Umieścić pojemnik CAD wraz z dołączonymi pojemnikami do przechowywania na agitatorze płytek na okres od sześciu do 16 godzin. Pozwoli to na zredukowanie pozostałego amlinu do stężenia mniejszego lub równego 2 µM.

Po zakończeniu procesu CAD wyjmij jednostki płytek krwi z agitatora, powieś płytki, przełam kaniulę przy wylocie pojemnika CAD i pozwól płytkom spłynąć do dwóch pojemników do przechowywania. Następnie usuń powietrze z pojemników do przechowywania. Uszczelnij przewody powyżej rozdzielacza w kształcie litery Y i zdejmij pojemnik CAD.

W wyniku otrzymano dwa koncentraty krzep płytek z nieaktywnymi patogenami do oceny funkcji płytek krwawiczych in vitro. Wyznaczono dawkę płytek, pH, pO₂, produkcję mleczanów oraz zużycie glukozy w próbkach. Parametry koncentratów krzep płytek określano do siódmego dnia przechowywania.

Rysunek ten przedstawia średnią początkową dawkę płytek w podwójnej dawce koncentratu płytek przed zabiegiem intercept oraz średnią dawkę płytek w każdym z leczonych produktów rozdzielonych do siódmego dnia przechowywania. Jak widać, strata płytek podczas przechowywania wyniosła około 9%. Redukcja ta nie różni się od oczekiwanej straty płytek podczas przechowywania konwencjonalnych koncentratów płytek. Zgodnie z wymogami europejskimi, pH płytek musi pozostać powyżej 6,4 do końca okresu ważności.

Podczas przetwarzania pH koncentratów platelets spada nieznacznie, w zależności od objętości stężenia platelets oraz przepuszczalności gazowej pojemnika do ich przechowywania. Rysunek ten przedstawia pH rozdzielonych produktów platelets w ciągu siedmiu dni przechowywania; podczas tego okresu pH pozostaje stabilne i utrzymuje się w granicach wymagań procesowych. Metabolizm tlenowy powinien nadal zachodzić w przechowywanych platelets i jest wskaźnikiem zdolności platelets do funkcjonowania in vivo po przetoczeniu pacjentowi.

Zużycie O2 oraz produkcja CO2 przez płytki krwi wskazują na kontynuację procesu oddychania w płytkach znajdujących się w pojemniku PL 24 10 podczas siedmiodniowego przechowywania. Podobnie, w przechowywanych płytkach powinien kontynuować się metabolizm beztlenowy. Zatem zużycie glukozy i produkcja mleczanów są również wskaźnikami zdolności płytek do funkcjonowania po transfuzji.

Te dwie ryciny przedstawiają poziomy mleczanów i glukozy w ciągu siedmiu dni przechowywania. Zużycie glukozy przez płytki krwi oraz produkcja mleczanów są ze sobą spójne. W ciągu siedmiu dni przechowywania w pięciu jednostkach poziom glukozy wynosił mniej niż 1,11 mmol/L, co stanowi dolną granicę oznaczalności testu glukozy.

Przygotowanie i walidacja łączenia warstwy leukocyto-płytkowej (buffy coat) pozwoliły na uzyskanie koncentratów płytkami krwi spełniających kryteria wejściowe dla procesu inaktywacji patogenów (intercept treatment), w szczególności w zakresie objętości, liczby płytek krwi, stosunku osocza oraz stopnia zanieczyszczenia erytrocytami. Końcowe jednostki spełniały kryteria walidacyjne przez siedem dni przechowywania, w tym w odniesieniu do dawki płytek oraz pH. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalną metodą przygotowania warstwy leukocyto-płytkowej, która pozwala na uzyskanie pojedynczej dawki koncentratu płytek, jest maksymalizacja wydajności komponentów z pobranych jednostek krwi, obniżenie kosztów operacyjnych dzięki zastosowaniu techniki podwójnej dawki oraz poprawa bezpieczeństwa pacjentów poprzez inaktywację patogenów przenoszonych drogą transfuzyjną.