Tani układ do behawioralnej audiometrii u gryzoni

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie danych dotyczących behawioralnego hamowania reakcji startlowej na bodźce słuchowe (pre-pulse inhibition) w celu określenia progu słyszenia oraz subiektywnego odczucia szumu usznego u gryzoni z wykorzystaniem niskokosztowej aparatury. Osiąga się to poprzez najpierw zgromadzenie pełnego zestawu danych behawioralnych od zdrowego zwierzęcia, a następnie wywołanie uszkodzenia słuchu za pomocą łagodnej, specyficznej dla częstotliwości traumy akustycznej.

Trzecim krokiem jest uzyskanie analogicznych danych behawioralnych u zwierzęcia z upośledzeniem słuchu. Następnie analizuje się dane w celu pomiaru stopnia utraty słuchu oraz ewentualnej percepcji tinnitusu. Ostatecznie wyniki mogą wykazać nie tylko zmiany progu słyszalności, ale także tinnitus specyficzny dla danej częstotliwości.

Pomiary behawioralne reakcji przestrachu zostaną zademonstrowane przez SA, postdocta, oraz Z ave, doktoranta w moim laboratorium. Najpierw należy złożyć komputer PC z niezbędnym wyposażeniem. Całkowity koszt tej konfiguracji wynosi około 3 500 euro, w porównaniu do standardowego sprzętu, który może kosztować od 15 000 do 20 000 euro.

Zestaw ten obejmuje przetwornik DA połączony z modułem rozdzielczym (breakout box) i wzmacniaczem, kamerę internetową z podczerwienią oraz oprogramowanie MATLAB z uruchomionym zintegrowanym środowiskiem programistycznym. Wzmacniacz jest podłączony do głośnika w wygłuszonej komorze, która jest monitorowana przez kamerę i wyposażona w izolowaną płytkę z czujnikami, czujnik piezoelektryczny oraz klatkę do unieruchomienia gryzonia wewnątrz wygłuszonej komory. Do kontroli dźwięku służy również mikrofon.

Niezależnie od jakości wzmacniacza i głośnika, system musi zostać skalibrowany za pomocą wzmacniacza pomiarowego w celu wyznaczenia funkcji przejścia częstotliwościowego dla układu. Ponadto system musi zostać dostosowany do zakresu słyszalności badanego zwierzęcia. Wyjmij zwierzę z klatki domowej i umieść je głową do przodu w rurce stabilizacyjnej.

Zamknij drzwiczki, umieść probówkę w komorze na piankowych nóżkach, a czujnik wyłączy wszelkie światła zewnętrzne. Zamknij drzwiczki komory i odczekaj 15 minut, aby zwierzę przyzwyczaiło się do układu. Uruchom program i zdefiniuj parametry stymulacji.

Bodźce składają się z czystych tonów o różnych częstotliwościach. Bodźce testowe poprzedzające bodźce wywołujące reakcję przestrachu są prezentowane przy zmiennych częstotliwościach i natężeniach. W przypadku podejścia nierandmizowanego, np. przy ustalonym jednym poziomie bodźca testowego dla wszystkich badanych częstotliwości, należy przewidzieć pięć minut czasu na regenerację pomiędzy zestawami bodźców.

Przed analizą danych należy usunąć z zestawu danych nieprawidłowe próby, takie jak te, w których zwierzę poruszyło się przed bodźcem wywołującym reakcję przestrachu. Walidacja pojedynczych prób jest bardzo ważna, ponieważ odpowiedzi na bodziec wywołujący reakcję przestrachu mają tendencję do bycia znacznie silniejszymi po tym, jak zwierzę się poruszyło. Takie odpowiedzi muszą zostać odrzucone.

Następnie wyznacz amplitudę i latencję reakcji przestrachowej w oknie czasowym pierwszych 50 milisekund po bodźcu wywołującym przestrach; amplituda reakcji jest odległością między pierwszym maksimum a pierwszym minimum odpowiedzi. Latencja to czas od rozpoczęcia bodźca do wystąpienia reakcji. Próg słyszalności uzyskuje się poprzez dopasowanie funkcji Boltzmanna do pełnego zestawu danych amplitudy odpowiedzi dla jednej częstotliwości, posortowanych według natężenia przedbodźcowego pojedynczych prób.

Punkt 50% funkcji Boltzmanna wskazuje próg słyszenia dla tej częstotliwości stymulacji. Odpowiedzi na czysty bodziec przeustraszenia bez jakiejkolwiek wstępnej stymulacji mogą służyć jako punkt odniesienia dla późniejszych obliczeń. Aby wywołać uraz słuchu u gryzoni, najpierw znieczul zwierzę, wstrzykując podskórnie trzy mililitry na kilogram środka znieczulającego, w tym dawkę atropiny.

Odczekaj około pięciu minut i sprawdź odruchy zwierzęcia. Aby utrzymać znieczulenie podczas pomiarów, stale podawaj taką samą objętość roztworu znieczulającego za pomocą pompy strzykawkowej. Przez każdą godzinę przebywania w komorze zwierzę powinno być ogrzewane za pomocą mata grzewczego.

Przez 75 minut poddaj zwierzę działaniu głośnego, czystego tonu w celu wywołania urazu akustycznego. Po odczekaniu pięciu dni na stabilizację stanu zwierzęcia, sporządź nowy audiogram; minimum pięciu dni na rozwój szumów usznych jest kluczowe dla uzyskania wiarygodnych wyników. W pierwszym subiektywnym paradygmacie szumów usznych zastosuj następujące parametry stymulacji.

Ustaw natężenie dźwięku wyzwalającego reakcję przestrachu na 105 decibels, SPL, i zmieniaj częstotliwości od 1 do 16 kilohertz w pojedynczych oktawach. Rozpocznij od prezentacji tła z szumem białym o natężeniu 50 decibels, SPL, z 15 millisecond przerwą lub bez niej. W przypadku zastosowania podejścia nielosowego, zapewnij pięć minut odpoczynku pomiędzy różnymi zestawami bodźców.

Użycie różnych częstotliwości bodźców wywołujących reakcję przestrachu pozwoli na przybliżone oszacowanie postrzeganej częstotliwości szumów usznych. W drugim subiektywnym paradygmacie szumów usznych należy zastosować następujące parametry stymulacji: natężenie dźwięku wywołującego reakcję przestrachu na poziomie 105 decybeli SPL z bodźcem w postaci podwójnego kliknięcia. Należy rozpocząć od szumu filtrowanego pasmowo.

Tło na poziomie 50 decybeli, SPL. Ponownie, w przypadku zastosowania podejścia nierandmizowanego, należy zapewnić pięć minut przerwy między różnymi zestawami bodźców. Po usunięciu z zestawu danych wszystkich nieprawidłowych prób, należy wykonać następujące obliczenia dla każdej pozostałej próby.

Po pierwsze, w ciągu pierwszych 50 milisekund po bodźcu startlowym, należy zmierzyć amplitudę odpowiedzi oraz latencję odpowiedzi. Po drugie, należy znormalizować wszystkie dane do zbioru referencyjnego.

Zbiorem danych referencyjnych jest amplituda odpowiedzi na bodziec startlowy w postaci czystego tonu bez żadnego bodźca wstępnego; częstotliwość testowa jest określana albo przez czysty ton, albo przez częstotliwość środkową szumu filtrowanego pasmowo. Oblicz średnią odpowiedź dla każdego punktu odniesienia. Następnie znormalizuj każdą amplitudę odpowiedzi, dzieląc ją przez odpowiadającą jej wartość referencyjną.

Następnie, wykorzystując wartość średnią dla znormalizowanego stanu bez przerwy (no gap), oblicz PPI dla każdego badanego stanu. Na tym etapie można obliczyć procentową zmianę PPI po urazie dla każdej badanej częstotliwości. Podobnie można bezpośrednio porównać PPI przed i po urazie.

Dzięki zastosowaniu opisanego paradygmatu reakcje przestrachowe są łatwe do wywołania i analizy. Większość prób jest poprawna. Próby nieprawidłowe są łatwe do zidentyfikowania.

Są one zaznaczone czerwonymi kwadratami i zostały pominięte w analizie. Typowa zmiana progu behawioralnego odnotowana przed i po urazie akustycznym przy częstotliwości 2 kHz wykazuje wyraźny ubytek słuchu przy 2 kHz. Po wywołaniu urazu słuchu zbadano znormalizowane amplitudy odpowiedzi dla stymulacji o oktawę niższą i oktawę wyższą od częstotliwości urazu poniżej częstotliwości urazu.

Nie stwierdzono zmiany wzorca odpowiedzi powyżej częstotliwości urazowej. Efekt przerwy przed bodźcami zanikł, co wskazuje na brak percepcji przy tej częstotliwości. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak pozyskiwać i przetwarzać dane behawioralne dla progu słyszenia oraz jak przeprowadzać ocenę percepcji u gryzoni z wykorzystaniem niskokosztowego układu do badania reakcji przestrachu.