Przygotowanie linii komórkowych do warunkowego wyciszenia ekspresji genu i pomiar efektów wyciszenia w odniesieniu do indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest obserwacja wpływu wyciszenia ACF1 lub SNF2H na indukowaną przez E4 lub 4 śmierć komórek. Osiąga się to poprzez wytworzenie linii komórkowych, w których ekspresja srna ACF1 lub SNF2H jest aktywowana warunkowo poprzez dodanie doksycykliny, co w drugim kroku skutkuje obniżeniem poziomów białka ACF1 lub SNF2H. Komórki otrzymanych linii komórkowych są traktowane doksycykliną w celu zmniejszenia ekspresji ACF1 lub SNF2H lub pozostawiane bez obróbki.

Następnie E4orf4 jest ekspresowany w komórkach z lub bez odpornego shRNA przeciwko ACF1 lub SNF2H. W celu zbadania wpływu ACF1 lub SNF2H na indukowaną przez E4orf4 śmierć komórek, uzyskano wyniki wykazujące wpływ poziomów ACF1 lub SNF2H na toksyczność E4orf4 na podstawie zliczania jąder o morfologii apoptotycznej przy użyciu testu JY. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak przejściowa transfekcja RNA, jest to, że wszystkie komórki ekspresują shRNA, a odsetek komórek wykazujących koekspresję wraz z tradycyjnym plazmidem jest wyższy. Metoda ta pozwala na poznanie mechanizmów leżących u podstaw indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek, ale może być również stosowana do badania innych białek protycznych.

Oprócz Any Lafe, części tej procedury zaprezentuje badacz z mojego laboratorium. Aby rozpocząć procedurę generowania indukowalnych linii komórkowych, należy wysiać komórki T-Rex 2 9 3 z gęstością około 5×10⁶ komórek na płytkę 10 cm w 8 ml DMEM zawierającego serum bez tetracykliny oraz 5 µg/ml blasticydyny, a następnie inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnego dnia, przed transfekcją, należy wymienić medium na 8 ml świeżego medium. Plazmidem do transfekcji jest plazmid P superior neo plus GFP kodujący ACF1 lub SNF2 H-S-H-R-N-A, sterowany indukowalnym tetracykliną promotorem H1, a także gen oporności na neomycynę połączony z GFP i sterowany konstytutywnym promotorem PGK.

Do 500 µL 150 mM chlorku sodu dodać 10 µg plazmidowego DNA i wymieszać w wirówce typu vortex. Następnie, do drugiej probówki zawierającej 500 µL 150 mM chlorku sodu dodać odczynnik jet PY w ilości 2 µL na 1 µg DNA i wymieszać w wirówce typu vortex. Roztwór jet pie dodać do DNA i dokładnie wymieszać za pomocą vortexowania.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po 15 minutach ostrożnie nanieść kompleksy DNA pipetą na płytki 10 centymetrowe zawierające komórki T-Rex 2 9 3 o konfluencji od 70 do 80% w dniu następnym.

Wymień pożywkę na pożywkę selektywną, w tym przykładzie ponownie DMEM, zawierającą 500 µg/mL G418. Przez kolejne dwa tygodnie monitoruj komórki. Co trzy do czterech dni wymieniaj pożywkę selektywną na analogiczną świeżą pożywkę, aż do pojawienia się kolonii.

Zidentyfikuj kolonie wzrokowo i zaznacz ich położenie na spodzie płytki za pomocą kolorowego markera. Zweryfikuj pod mikroskopem, czy kolonie są odpowiednio odseparowane. Kolonie można izolować, gdy osiągną rozmiar umożliwiający ich wizualizację bez użycia mikroskopu.

Dla powodzenia tej procedury ważne jest wybranie dobrze odseparowanych kolonii podczas izolacji kolonii. W komorze z laminarnym przepływem powietrza odessaj pożywkę z płytki. Delikatnie przemyj roztworem PBS i dokładnie odessaj całą pozostałą ciecz.

Nanieś trzy mikrolitry 0,25% trypsyny w EDTA na jedną kolonię na płytce, wielokrotnie rozprowadzając trypsynę pipetą, aż komórki odkleją się od powierzchni płytki. Przenieś komórki do pożywki selektywnej w dołku płytki 24-dołkowej. Powtórz tę procedurę dla kilku innych kolonii na płytce.

Hodować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% carbon dioxide aż do wypełnienia dołka. Następnie podzielić komórki z każdej oryginalnej kolonii do trzech dołków w osobnej płytce 12-dołkowej i inkubować przez noc do następnego dnia. W jednej płytce zastąpić pożywkę pożywką zawierającą 1 µg/mL doxycycline z roztworu zapasowego przygotowanego w wodzie dwukrotnie destylowanej.

W płytce kontrolnej należy wymienić pożywkę na pożywkę bez doksycykliny. Komórki inkubuje się w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 przez 72 godziny. Następnie komórki z jednej studni poddanej działaniu czynnika oraz jednej studni nietraktowanej zbiera się do analizy western blot w celu określenia wydajności wyciszenia ACF1 lub SNF2H; reprezentatywny wynik przedstawiono tutaj.

Blot ten zabarwiono przeciwciałami przeciwko SNF2H i alfa-tubulinie. Ta ostatnia służyła jako kontrola ilości białka dla dwóch klonów. Klon numer cztery oraz numer pięć wykazały silną redukcję SNF2H po indukcji doksycykliną i zostały zatem wybrane do użycia w eksperymencie z wyciszeniem genu, który zostanie przedstawiony w następnym fragmencie.

Nieleczone komórki na trzeciej płytce zostaną wykorzystane do namnożenia wyselekcjonowanej linii komórkowej, a następnie zamrożone zostaną alikwoty tych komórek. Aby w dalszej kolejności wywołać knockdown ACF1 lub SNF2H w komórkach na płytkach 10 cm w pożywce selektywnej, do połowy płytek należy dodać doksycyklinę w stężeniu 1 µg/mL i inkubować w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2 przez 48 do 72 godzin. Każda grupa płytek musi zapewnić komórki do 12 płytek 6 cm, w tym dwa duplikaty do testu DPI dla każdego punktu, a także jedną płytkę do analizy western blot dla każdej próbki.

Od 48 do 72 godzin po indukcji zdejmij komórki z każdej grupy za pomocą trypsyny, a po ich przeliczeniu wysiej 1,5 × 10⁶ komórek na płytkę 6 cm w tym samym medium z doksycykliną lub bez niej. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2 przez noc; następnego dnia przeprowadź transfekcję komórek zgodnie z opisem.

Zarówno komórki nieleczone, jak i traktowane doksycykliną, poddano transfekcji w czterech wariantach, każdy w trzech powtórzeniach. Pierwszy obejmował pusty plazmid oraz plazmid wyrażający GFP; drugi pusty plazmid oraz wektor wyrażający oporny na SHRA ACF1-GFP lub SNF2H-GFP; trzeci plazmid kodujący E4 lub E4 oraz plazmid wyrażający GFP; a czwarty plazmid kodujący E4 oraz wektor wyrażający oporny na SHRA ACF1-GFP lub SNF2H-GFP. Po transfekcji wszystkie płytki inkubowano przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.

Dzień po transfekcji komórek należy wyekstrahować białka z jednej płytki na próbkę do analizy Western blot, aby potwierdzić, że ACF one lub SNF two H zostały skutecznie wyciszone, a E four or four wykazuje równy poziom ekspresji w różnych próbkach. Pozostałe 16 płytek zostanie wykorzystanych do testu DPI. Odessać pożywkę z płytek przeznaczonych do testu DPI i delikatnie przemyć komórki roztworem PBS w dygestorium chemicznym.

Dodaj jeden mililitr 4% paraformaldehydu przygotowanego w PBS, aby pokryć komórki, i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej bez wstrząsania. Odessaj paraformaldehyd i przemyj PBS, wstrząsając w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Powtórz płukanie jeszcze dwa razy, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania; po trzecim przemyciu PBS dodaj 80% etanol przechowywany w temperaturze -20 °C i inkubuj w -20 °C przez co najmniej jedną godzinę.

Odssać etanol i przemyć komórki dwukrotnie PBS, wstrząsając w temperaturze pokojowej przez pięć minut podczas każdego etapu, a następnie przemyć raz przez pięć minut w temperaturze pokojowej PBS zawierającym 0,5% BSA i 0,05% Tween 20 (PBSBT). Procedurę tę również należy przeprowadzać z wstrząsaniem, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał. Zablokować komórki w jednym mililitrze buforu PBSBT zawierającego 10% surowicy koziej przez 20 minut, wstrząsając w temperaturze pokojowej.

Następnie komórki należy przemyć dwukrotnie w P-B-S-B-T, przez pięć minut każde płukanie. Inkubować komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym, w tym przypadku przeciwciałem specyficznym dla E4 lub 4, w 1 mL P-B-S-B-T przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy jednoczesnym wstrząsaniu. Następnie przemyć dwukrotnie w P-B-S-B-T i raz w PBS zawierającym 0,1% BSA, przez pięć minut każde płukanie.

Następnie do komórek dodaje się 1 mL PBS 0,1%BSA zawierającego odpowiednie przeciwciało wtórne znakowane fluorescencyjnie oraz DPI w stężeniu końcowym 0,5 µg/mL. Inkubować przez 40 minut w ciemności w temperaturze pokojowej przy ciągłym wytrząsaniu. Na koniec przemyć PBS przez pięć minut.

Osusz dołek poprzez aspirację i pozostaw płytki odwrócone dnem do góry przez dodatkową godzinę lub przez noc w celu całkowitego wysuszenia, a następnie przykryj folią aluminiową. Zamocuj szkiełka nakrywkowe na komórkach, używając roztworu Flora Mount G. Przechowuj płytki w temperaturze 4 °C w ciemności do momentu rozpoczęcia liczenia. Komórki z apoptotycznymi jądrami, które zostały poddane różnym zabiegom opisanym w protokole, utrwalono i zabarwiono swoistymi przeciwciałami E4 lub 4 oraz DPI, aby zwizualizować jądra komórek przetransfekowanych.

Rysunek ten przedstawia przykład komórek wykazujących ekspresję E four or four oraz GFP; panel A pokazuje kontrolną ekspresję samego białka GFP, a panel B pokazuje ekspresję E four or four. Barwienie jąder DAPI przedstawiono w panelu C, a obrazy po nałożeniu w panelu D. Białe strzałki wskazują przetransfekowane komórki GFP i E.Four or four zawierające jądra o morfologii apoptotycznej. Czerwone strzałki wskazują jądra o nieregularnych kształtach, które nie zostały zaliczone jako jądra apoptotyczne; gwiazdki oznaczają jądra w fazie mitozy lub jądra, które właśnie uległy podziałowi. Liczbę kondensowanych lub pofragmentowanych jąder uwidocznionych za pomocą barwienia DAPI policzono w celu obliczenia procentowego udziału jąder o morfologii apoptotycznej w populacji komórek przetransfekowanych, aby zachować optymalny obiektywizm badania.

Zliczanie jąder apoptotycznych w poszczególnych próbkach przeprowadzono metodą ślepą, w której osoba dokonująca zliczeń nie znała tożsamości próbki. Reprezentatywny wynik przedstawiono na tym wykresie. Wyższe odsetki nieprawidłowości jądrowych zaobserwowano w komórkach wykazujących ekspresję E4orf4, co potwierdza, że E4orf4 indukuje śmierć komórek. Najwyższy odsetek nieprawidłowości jądrowych odnotowano w komórkach wykazujących ekspresję E4orf4, w których poziomy ACF1 zostały obniżone za pomocą knockdownu zapośredniczonego przez shRNA, co wskazuje, że knockdown ACF1 nasila indukowaną przez E4orf4 śmierć komórek oraz zwiększa toksyczność E4orf4 w komórkach.

Wykazanie niskiego poziomu ACF nie wynikało ze wzrostu poziomów E four lub four, co potwierdzono w analizie Western blot. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby ułatwić dokładne liczenie jąder apoptotycznych za pomocą DPI i zastosować rygorystyczne kryteria identyfikacji tych jąder. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak testy klonogenne, w celu walidacji wyników analizy DA pse.

W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania można zastosować inne metody, takie jak testy koimmunoprecypitacji. Przykładowo, można w ten sposób sprawdzić, czy między badanymi białkami zachodzi interakcja fizyczna.