Analiza obrazowa oddziaływań neuronów z glejem w systemie kokultury aksonów neuronowych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej (MCP)

Niniejszy protokół wprowadza nowatorską platformę do kokultury aksonów neuronalnych i astroglei w celu analizy oddziaływań neuron-glej z wykorzystaniem obrazowania o wysokiej rozdzielczości. W pierwszej kolejności należy złożyć mikrofluidyczną komorę hodowlaną, przygotować kultury neuronalne i pobudzić aksony neuronalne do przejścia na drugą stronę MCP. Następnie należy dodać hodowlane astrocyty, aby ustanowić skompartmentowany system kokultury; uzyskane wyniki, w tym obrazowanie time-lapse z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej, mogą pomóc w zrozumieniu oddziaływań między aksonami, astrogleją a aksonami neuronalnymi.

Pomysł na tę metodę pojawił się podczas próby oddzielenia wpływu wypustek neuronalnych od wydzielin neuronalnych na regulację GT. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą zazwyczaj mają trudności z indukowaniem wzrostu aksonów do innej części komory komórkowej. Wymaga to wysokiej gęstości zdrowych neuronów wysianych po stronie neuronalnej, przy czym neurony powinny znajdować się w pobliżu kanałów centralnych.

Otwarte komory MCP są przeznaczone do hodowli przedzielonych różnych typów komórek; powłoki z poliuretanu i lamininy są niezbędne do wysiewu neuronów i astrocytów w kokulturze. Najpierw nanieś roztwór poliuretanu w stężeniu 1 mg/mL na sterylne szalki z szklanym dnem i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc. Przemyj pokryte szalki z szklanym dnem trzy razy wodą dwukrotnie destylowaną, a następnie umieść pod sterylnym dygestorium w celu osuszenia.

Następnie pokryj szalkę lamininą w stężeniu 1 mg/ml i pozostaw do wyschnięcia pod światłem UV przez jedną godzinę. Montaż MCP na szalce z szklanym dnem należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Ustaw platformę do hodowli mikroprzepływowej tak, aby centralne kanały łączące znajdowały się na jej spodniej stronie, a następnie szczelnie przylegaj ją do pokrytego szkła.

Naczynia denne. Dodaj standardowe pożywki do hodowli neuronów lub astrocytów po obu stronach zmontowanego MCP. Inkubuj komorę przez dwie do czterech godzin w temperaturze 37 °C i sprawdź, czy nie występuje przeciek między MCP a szkłem.

Dolna część naczynia. Hodowle komórek neuronów kory są świeżo przygotowywane z mózgów myszy w 14. do 16. dniu embrionalnego rozwoju. Po wycięciu mózgu myszy należy usunąć oponami mózgowymi z kory pod mikroskopem stereoskopowym.

Za pomocą żyletki posiekaj tkankę na małe fragmenty, a następnie umieść je w probówce po wirowaniu. Odlej medium znad osadu i dodaj 0,05% trypsyny na 10 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Rozdziel komórki poprzez delikatne potrząsanie przy użyciu wypalanej pipety Pasteura.

Przefiltruj próbkę przez sito o oczkach 70 µm, aby uzyskać klarowną zawiesinę komórek neuronalnych, wykorzystując medium do wysiewu neuronów uzupełnione o 5% FBS. Naniesie 150 µL neuronów na prawą stronę zmontowanej płytki MCP.

Wysoka gęstość neuronów wynika z faktu, że tylko te komórki, które przytwierdzą się w obszarze retencji komórek, są w stanie rozwinąć aksony przez kanały centralne na drugą stronę zmontowanego MCP. Następnego dnia należy ostrożnie odessać medium z obszaru wysiewu komórek w komorze i zastąpić medium do wysiewu neuronów standardową pożywką do hodowli neuronów.

Do pożywki po stronie astrocytów w komorze należy dodać 20 nanogramów na mililitr czynnika neurotroficznego pochodzenia glejowego (GDNF). Tworzy to gradient chemiczny, który pomoże indukować wzrost aksonów z poziomu neuronalnego przez kanały centralne zmontowanego MCP. Po dwóch dniach należy monitorować obecność aksonów wnikających do kanału centralnego.

Po wejściu aksonów do kanału centralnego, zazwyczaj docierają one do przeciwległej strony w ciągu jednego dnia. Aksony pozostają zazwyczaj nienaruszone przez co najmniej jeden tydzień po dotarciu na drugą stronę. Po dysocjacji mózgu myszy w wieku od P1 do P3, zasiano astrocyty do 10 centymetrowych naczyń pokrytych poliuretanem.

Kulturować komórki przez noc, codziennie uzupełniając pożywkę do hodowli astrocytów przez kolejne dwa dni, a następnie raz na trzy dni. Po siedmiu dniach, gdy astrocyty utworzą warstwę jednowarstwową o 90% konfluencji, zebrać komórki za pomocą trypsyny. Około pięć dni po wysianiu neuronów odessać GDNF. Następnie nanieść 150 µL resuspendowanych astrocytów na lewą stronę zmontowanego MCP. W momencie, gdy aksony zaczynają wnikać lub właśnie wniknęły po ponownym wysianiu astrocytów, aksony, które weszły na lewą stronę zmontowanego MCP, wchodzą w bezpośrednią interakcję z astrocytami, albo poprzez bezpośredni kontakt aksonalny, albo poprzez uwalnianie czynników rozpuszczalnych.

Monitoruj astrocyty pod kątem przylegania do obszaru retencji komórek. Przeprowadź immunobarwienie komórek w przedzielonym systemie kokultury, aby zwizualizować specyficzne białka, takie jak te zaangażowane w interakcje między aksonami a astrocytami. Przedzielony system kokultury neuronów i astrocytów pozwala na selektywną interakcję astrocytów wyłącznie z wypustkami neuronalnymi, w szczególności z aksonami.

W niniejszym opracowaniu opisujemy indukowaną przez aksony aktywację transkrypcyjną transportera glutaminianu astrogleju. Badania te wykorzystują myszy transgeniczne, u których ekspresja fluorescencyjnego reportera EGF znajduje się pod kontrolą promotora genomowego GT1. Wysoka gęstość neuronów jest hodowana w obszarze retencji komórek zmontowanego MCPA; powiększony widok pokazuje aksony przecinające kanały centralne i wnikające na drugą stronę, przy czym barwienie beta III tubuliną ujawnia stożek wzrostu aksonu.

System MCP umożliwia monitorowanie pęczków aksonów podczas ich wzrostu przez kanał centralny i przechodzenia na drugą stronę. Barwienie immunohistochemiczne na GLT-1 identyfikuje astrocyty w części glialnej systemu MCP. Obraz przedstawia kontakt pomiędzy aksonami a astrocytami wykazującymi pozytywną ekspresję GLT-1.

Ekspresja reportera EGFP koreluje z aktywacją endogennego promotora GT one, ekspresją białka oraz aktywnością funkcjonalną. Ocena aktywności promotora GT one w pojedynczych astrocytach w C two wykazuje znacząco zwiększoną immunoreaktywność GLT one w przedzielonym systemie kokultury. Co istotne, system MCP umożliwia obrazowanie time-lapse w celu monitorowania zmian dynamicznych.

Na przykład dane te wykazują aktywację promotora GT1 indukowaną przez aksony w obecności astrocytów z transgenem GT1 EGFP i neuronów typu dzikiego dzień po wysianiu astrocytów. Obserwowana jest minimalna fluorescencja EGFP. Intensywność EGFP wzrasta znacząco 48 godzin po rozpoczęciu kokultury, gdy aksony głęboko wnikają w obszar astrocytów i wchodzą z nimi w bezpośredni kontakt.

Leczenie kininą po neuronalnej stronie zmontowanego MCP wywołało śmierć komórek neuronalnych. Co ciekawe, stymulowało ono również retrakcję i degenerację aksonów, a także spadek fluorescencji EGFP w aksonach. Te dynamiczne zmiany intensywności fluorescencji EGFP w aksonach wyraźnie wykazały, że aktywność promotora Astroglia GT 1 jest modulowana przez interakcję aksonalną.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak ustanowić system hodowli rdzeniowej przy użyciu mikrofluidycznej platformy hodowlanej; po opanowaniu techniki ta może być prawidłowo wykonywana w ciągu kilku dni.