Test opóźnionej nadwrażliwości trans-vivo w badaniu regulacji specyficznej dla antygenu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie testu trans vivo DTH do monitorowania zarówno pro-, jak i przeciwzapalnych odpowiedzi swoistych względem antygenu u ludzi. Najpierw należy wyizolować mononuklearne komórki krwi obwodowej z krwi obwodowej badanego. Następnie preparat PBMC należy wymieszać z PBS.

Antygen przypominający testowy oraz antygen testowy wraz z antygenem przypominającym. Przeprowadzić pomiary wstępne poduszek stóp i wstrzyknąć przygotowane mieszaniny myszom w stanie spoczynku. Pomiary poduszek stóp powtórzyć po 24 godzinach. Trzy.

Kreskowe wzorce odpowiedzi DTH mogą mieć charakter regulacyjny, nieregulacyjny lub uwrażliwiony. Test trans vivo opóźnionej nadwrażliwości może być stosowany do określania parametrów klinicznych, takich jak odpowiedzi alloreaktywne, w których źródłem antygenu są komórki dawcy przeszczepu. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod in vitro jest możliwość łatwego wykrycia zarówno odpowiedzi prozapalnych, jak i regulacyjnych na alloantygeny, autoantygeny lub antygeny nowotworowe przy użyciu jednego systemu testowego.

Egon, badacz z mojego laboratorium, zademonstruje teraz procedurę, wykorzystując świeżą ludzką krew obwodową pobraną do probówek z kwasem cytrynowym i dekstrozą, aby uniknąć aktywacji płytek krwi. Wyizoluj PBMC, używając medium do separacji limfocytów zgodnie ze standardowymi metodami. Przemyj preparat PBMC roztworem PBS, aby usunąć zanieczyszczające go płytki krwi.

W przypadku zauważalnego zanieczyszczenia erytrocytami należy przeprowadzić lizę czerwonych krwinek, używając buforu do lizy CK. Następnie należy wykonać dwa kolejne przemycia w PBS Resus. PBMC należy zawiesić w PBS w stężeniu 10 milionów PBMC na mililitr dla antygenu allogenicznego.

Zacznij od P BMCs, wyizolowanych z krwi obwodowej dawcy zgodnie z procedurą przedstawioną wcześniej. Następnie resus. Zawieś komórki dawcy w PBS w stężeniu 120 milionów komórek na mililitr i dodaj jeden mikromol PMSF, aby zapobiec degradacji białek.

Następnie poddaj zawiesinę komórkową sonikacji, stosując siedem jednosekundowych impulsów za pomocą sonikatora z sondą o średnicy 2 mm. Używając cytometru hemocytometrycznego, potwierdź rozbicie ponad 90% komórek.

Następnie odwiruj mieszaninę z prędkością 14 000 RPM w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Ostrożnie przenieś nadsącz do probówki typu safe-lock i określ stężenie białka dla każdej iniekcji standardowymi metodami. Odmierz siedem aliquotów po 10⁶ PBMC do dwóch mililitrów.

Komórki w probówkach typu safe-lock należy osadzić w drodze wirowania. Najpierw należy przygotować zawiesinę kontrolną ujemną z PBMC w 35 µL PBS. Następnie, w przypadku kontroli dodatniej, należy dodać 25 µL antygenu przypominającego (tężec, toksoida; błonica, toksoida) i uzupełnić objętość iniekcji do 35 µL za pomocą PBS.

Zgodnie z planem eksperymentalnym oceny odpowiedzi specyficznej dla dawcy, resuspenduj osad komórkowy w 10 µL antygenu dawcy oraz 25 µL PBS, aby uzyskać objętość całkowitą 35 µL. W celu oceny eksperymentalnej regulacji specyficznej dla antygenu dawcy, resuspenduj osad komórkowy do objętości 35 µL, dodając 10 µL antygenu dawcy oraz 25 µL antygenu przypominającego TT DT. Po znieczuleniu myszy typu skid izofluranem, umieść suwmiarkę sprężynową w centrum poduszki stopy, tak aby jedna krawędź dotykała ostatniej poduszki opuszkowej stopy, aby zapewnić punkt odniesienia dla zachowania spójności miejsca pomiaru po ustabilizowaniu się odczytu miernika.

Zapisz wyjściową grubość poduszeczki stopy przed wstrzyknięciem. Umieść strzykawkę tak, aby igła była skierowana w stronę palców, a ścięcie igły było skierowane do góry. Następnie rozpocznij podskórne iniekcje każdej zawiesiny komórek w tylne poduszeczki stóp myszy.

Po pierwsze, powoli wstrzyknij do prawej poduszeczki stopy preparat kontroli negatywnej. Następnie wstrzyknij do lewej poduszeczki stopy kontrolę pozytywną w postaci PBMC plus TT dt. Teraz przenieś mysz z powrotem do klatki.

Po drugie, w prawą stopę wstrzyknij PBMC wraz z antygenem allogenicznym, a w lewą stopę PBMC wraz z antygenem allogenicznym oraz TT dt. Upewnij się, że od 18 do 24 godzin po iniekcji nie występuje wyciek. Z narkozuj każdą mysz izofluranem i powtórz pomiar obrzęku stopy.

Odjąć grubość każdej poduszki stopy przed iniekcją od wartości po iniekcji, aby uzyskać wartość obrzęku poduszki stopy. Następnie obliczyć specyficzny dla antygenu obrzęk netto, odejmując wartość obrzęku poduszki stopy kontrolnej od wartości obrzęku poduszki stopy uzyskanych w grupach badanych. Zweryfikować odczyt kontroli pozytywnej, przyjmując odpowiedź kontroli pozytywnej na antygen przypominający TT DT większą niż lub równą 25 × 10⁻⁴ cali.

Aby test można było uznać za prawidłowy, wymagana jest odpowiedź tła na PBS. Następnie należy określić stopień hamowania odpowiedzi przypominających w obecności antygenów dawcy. Eksperyment ten służy ocenie biorców przeszczepów nerek pod kątem odpowiedzi specyficznej dla antygenów dawcy oraz regulacji.

Wśród biorców przeszczepów wyróżnia się trzy główne wzorce nadwrażliwości opóźnionej: regulacyjny, nieregulacyjny oraz uczulony. Wszyscy pacjenci wykazali silną odpowiedź na kontrolę pozytywną w postaci antygenu przypominającego tt. Pacjent numer 62 wykazuje wzorzec regulacyjny, który charakteryzuje się słabą odpowiedzią na antygen dawcy oraz wyraźną supresją powiązaną z odpowiedzią na antygen przypominający w obecności antygenu dawcy.

Jest to wzorzec, który uznano za związany z tolerancją allograftu narządu. Pacjent numer 48 wykazuje wzorzec nieregulacyjny, którego cechą jest słaba odpowiedź na dawcę, ale brak powiązanej supresji. Wzorzec ten był często obserwowany u pacjentów przyjmujących leki immunosupresyjne.

Pacjent numer osiem wykazuje wzorzec uczulenia na dawcę, charakteryzujący się silną odpowiedzią na antygen dawcy i brakiem powiązanej supresji. Odpowiedź ta wiąże się z odrzuceniem przeszczepu. W klinicznych studiach przypadków, PBMC od osób włączonych do badania obserwacyjnego poddano analizie pod kątem pośredniej ścieżki specyficznej dla dawcy oraz odpowiedzi limfocytów T efektorowych i T regulatorowych, aby ocenić rolę regulacji specyficznej dla dawcy w tolerancji klinicznej.

Pośrednie odpowiedzi efektorowe na antygeny dawcy wykazują wyraźne spektrum w zależności od grup rekrutacyjnych. Obrzęk poduszki stopy wzrasta w miarę przejścia stanu klinicznego pacjenta z grupy osób tolerancyjnych do osób z chronicznym odrzuceniem. W tym przypadku powiązany test supresji mierzy antydonorsową pośrednią drogę odpowiedzi limfocytów T regulatorowych.

Dane te wykazują spadek odpowiedzi regulacyjnych w zakresie od pacjentów najbardziej tolerancyjnych, przez pacjentów o tolerancji pośredniej, aż po pacjentów z najniższą tolerancją u osób z przewlekłym odrzucaniem przeszczepu. Podsumowując, regulacja odpornościowa mierzona za pomocą testu DTH trans vivo wydaje się być istotnym mechanizmem akceptacji allograftu nerki.

Obiecującym obszarem jest zastosowanie testu TDTH w monitorowaniu autoimmunizacji. Nasze badanie roli kolagenu typu V w procesie patologicznym zespołu zapalenia oskrzelików OBL wykazało, że najwyższe ryzyko względne rozwoju BOS zaobserwowano u pacjentów z dodatnią odpowiedzią PBMC z krwi obwodowej biorców przeszczepów płuc na kolagen V, a nie u zdrowych kontroli lub w przypadku kolagenu.

Czterech pacjentów z zespołem dobrego pastwiska wykazujących reaktywność po przeszczepie nerki często reagowało na kolagen typu V. Test TDTH może być również wykorzystany do badania reaktywności PBMC od pacjentów onkologicznych na antygeny swoiste dla nowotworu. Na przykład obecność limfocytów T regulatorowych swoistych dla PAP u pacjentów z rakiem prostaty może ograniczać odpowiedź na szczepienie antygenem PAP.

Test TRANSVAAL DTH jest nowoczesnym testem diagnostycznym o zastosowaniu klinicznym w ocenie komórkowych odpowiedzi immunologicznych u pacjentów po transplantacjach, z nowotworami oraz z chorobami autoimmunologicznymi. Jest on cenny, ponieważ znajduje zastosowanie nie tylko w monitorowaniu odpowiedzi przypominających efektorowych limfocytów T, ale może być również wykorzystany do wykrywania odpowiedzi regulatorowych limfocytów T, gdyż nie opiera się na pomiarze konkretnej cytokiny w celu wykrycia efektorowych lub regulatorowych limfocytów T. Metoda ta jest bardzo elastyczna i ma szeroki zakres zastosowań.