Nienaruszona charakterystyka histologiczna mikrourządzeń z implantami do mózgu i otaczających tkanek

Celem tej procedury jest zobrazowanie nienaruszonego interfejsu tkanki mózgowej wokół przewlekle wszczepionych mikrourządzeń w tkance mózgowej gryzoni. Osiąga się to poprzez użycie najpierw elastomeru silikonowego o szybkich komórkach i dwuczęściowego akrylu dentystycznego, aby pokryć kraniotomię i utworzyć czapeczkę czaszki wokół wszczepionego urządzenia. Po perfuzji zwierzęcia za pomocą utrwalacza i pośmiertnego przetwarzania tkankowego, część urządzenia z implantacją mózgu jest oddzielana od nasadki głowy poprzez wypalenie akrylu dentystycznego i przecięcie szybkiej komórki.

Następnie mózg jest usuwany i cięty za pomocą viome, aby uchwycić implant w wycinku tkanki. Ostatnim krokiem jest przygotowanie tkanki do obrazowania fluorescencyjnego poprzez mycie, znakowanie, a następnie oczyszczenie wycinka tkanki w optycznym roztworze czyszczącym. Ostatecznie mikroskopia konfokalna służy do pokazania nienaruszonej odpowiedzi biologicznej, jaką wytwarza penetrujący implant mózgowy w otaczającej tkance w skali subkomórkowej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak explaning, urządzenie, jest to, że technika ta pozwala uniknąć zakłócenia tkanki otaczającej i przylegającej do wszczepionego urządzenia, dzięki czemu tkanka współpracująca może być badana w stanie nienaruszonym. Metoda ta opiera się na zaawansowanych technikach immunohistochemicznych i mikroskopowych, a jej wynikiem są dane z mikroskopii konfokalnej, które szczegółowo opisują obszar otaczający urządzenie z implantem mózgu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuroprotetyki, takie jak stopień, w jakim miejscowa śmierć komórki, tworzenie blizn glejowych i reorganizacja naczyń krwionośnych naprawdę wpływają na żywotność mikroelektrod wszczepionych w mózg

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w przewlekły interfejs neuronowy wszczepionych w mózg układów mikroelektrod. Techniki związane z tą metodą można również zastosować w innych obszarach badań neurobiologicznych, w tym w wszczepionych kaniulach lub światłowodach W okapie oparowym rozpocznij procedurę od ostrożnego usunięcia skóry i innych tkanek wokół akrylowej czapki czaszki, używając kleszczy i małych nożyczek, nosząc rękawice niewrażliwe na ciepło. Użyj żołnierskiego żelazka, aby zrobić okno w akrylu wgniecenia i odsłonić obszar pod spodem szybkiego uszczelnienia.

Urządzenie powinno być widoczne zamknięte w przezroczystej szybkozłączce. Następnie, pod mikroskopem chirurgicznym, wytnij elastomer silikonowy za pomocą zakrzywionych mikronożyczek. Następnie usuń małe kawałki szybkiej uszczelki za pomocą pęsety i mikronożyczek aż do miejsca, w którym urządzenie wchodzi do mózgu.

Kontynuuj cięcie wzdłuż powierzchni kraniotomii, aby oddzielić elementy urządzenia przyczepiające się do polikrzemu i czaszki od elementów wszczepionych do mózgu. Zachowaj ostrożność podczas przecinania odsłoniętych elementów urządzenia. Unikaj wciskania lub przeciągania implantów w utrwalonej tkance.

Następnie ostrożnie usuń kość wokół nasadki głowy, używając następnie surowych shes. Użyj szpatułki, aby oddzielić mózg z wszczepionym urządzeniem od czaszki. Teraz umieść mózg na szklanej szalce Petriego wypełnionej HBHS.

Użyj bloku mózgowego i żyletek, aby podzielić mózg na sekcje i stworzyć płaską płaszczyznę ściśle dopasowaną do kąta wszczepionych urządzeń. Następnie wciśnij dwie żyletki przez tkankę mózgową, odsłaniając płaską powierzchnię, która zostanie zamontowana na Vibram. Następnie umieść trochę lodu pod platformą Vibram.

Następnie krótko osusz powierzchnię chusteczki na ręczniku papierowym. Następnie zorientuj próbkę tak, aby najszerszy wymiar był równoległy do kierunku ruchu wibrującego ostrza tonu, aby uniknąć potencjalnego przewrócenia tkanki przez ostrze, natychmiast przyklej płaską płaszczyznę do stolika za pomocą super kleju. Po nałożeniu kleju umieść schłodzony PBS na naczyniu vibrato wokół tkanki.

Teraz pokrój plastry tkanki o grubości od 250 do 500 mikronów, używając maksymalnej szybkości wibracji i powolnego tempa postępu ostrza przy kącie ostrza 10 stopni od poziomu. Następnie ostrożnie zbierz plastry za pomocą pędzla i szpatułki i przechowuj HBHS w 24-dołkowej płytce w temperaturze czterech stopni Celsjusza, zbierając plastry, zapisuj grubość i położenie każdego plasterka, gdy są one wyjmowane na płytkę 24-dołkową. Gdy urządzenie Insitu będzie widoczne, zbierz plasterek tkanki o grubości około 500 mikronów.

W celu uchwycenia wyrobu w pojedynczym wycinku tkanki w celu zebrania cieńszego fragmentu tkanki, można ostrożnie pobrać wycinki o grubości 100 mikronów, aby zbliżyć się do urządzenia. W tym momencie można zebrać plasterek o grubości mniejszej niż 500 mikronów z urządzeniem w środku. Przetwarzanie tkanek należy rozpocząć od trzykrotnego umycia plastrów po pięć minut na pranie w HBHS.

Następnie inkubuj je w wodorku boru sodu przez 15 minut. Z każdej strony plastra powoli obracaj plasterek za pomocą małego pędzla i unikaj dotykania jakichkolwiek obszarów wokół wszczepionego urządzenia. Wraz z małym pędzlem można również użyć mikro łyżki ze stali nierdzewnej lub teflonu.

Teraz umyj plastry trzy razy po pięć minut na pranie w roztworze myjącym o temperaturze pokojowej. Zablokuj je w roztworze myjącym na dwie godziny w temperaturze pokojowej, przewracając plastry. Po jednej godzinie, po dwóch godzinach, inkubuj plastry w przeciwciałie pierwszorzędowym przez około 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie wykonaj sześć szybkich, trzyminutowych myć roztworem myjącym. Następnie wykonaj sześć godzinnych płukań w roztworze do mycia. Następnie inkubuj je w przeciwciałie drugorzędowym przez około 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ponownie wykonaj sześć szybkich, trzyminutowych myć, a następnie sześć jednogodzinnych płukań w roztworze myjącym. Następnie usuń roztwór myjący i dodaj roztwór czyszczący U2 na bazie glicerolu. Przykryj talerz folią i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Pozostaw grube plastry do usunięcia około tygodnia lub bardzo grube skrawki tkanki przez dwa do trzech tygodni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu zamontuj skrawki tkanek na szkiełkach, używając roztworu czyszczącego jako nośnika montażowego. Uszczelnij wszystkie szkiełka przezroczystym lakierem do paznokci i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza z dala od światła, używając obiektywów mikroskopowych o większej odległości roboczej.

Rozpocznij obrazowanie za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrujemy za pomocą oprogramowania XS L SM seven 10 Carl Xi send i sterowanego komputerowo stolika translującego XY na obraz Panorama 3D wokół implantu w celu skorygowania współczynnika załamania światła roztworu czyszczącego. W tej demonstracji wprowadzamy wartość współczynnika załamania światła wynoszącą 1,4 w oprogramowaniu mikroskopu Leica Zen dla rozwiązania do czyszczenia U2.

To ustawienie subtelnie dostosowuje odstępy kroku Z, aby uwzględnić niedopasowanie współczynnika załamania światła w tkance w pobliżu urządzenia. Z grubsza oceń odpowiednie okno osi Z i ustawienia zbierania danych w wymiarze zdi dla każdego kanału fluorescencyjnego przy użyciu niskiej mocy lasera, około 0,5 do 5% i dużych rozmiarów kroku Z. Następnie użyj oprogramowania Zen panorama, aby ustawić obiektyw w środku XY ostatecznej panoramy i określić liczbę pozycji zbierania wymaganych dla osi x i y.

Aby objąć obszar zainteresowania, ponownie oceń i sfinalizuj okno zbierania osi Z, szybko sprawdzając pierwszą i ostatnią klatkę stosu. Następnie ręcznie ustaw czułość detektora i moc lasera, aby odpowiednio narastały wraz ze zwiększoną głębokością. Celem jest zazwyczaj utrzymanie w przybliżeniu tej samej intensywności obrazu niezależnie od głębokości obrazowania w wycinku tkanki, a także uniknięcie wysokiego szumu tła.

W razie potrzeby zbierz każdą serię danych obrazu fluorescencyjnego, aby uniknąć nakładania się sygnałów, sekwencyjnie uruchamiaj linie laserowe. Zmień ustawienia oprogramowania, aby zbierać dane lub dane dotyczące transmitancji i użyj dłuższego, bardziej penetrującego lasera o większej długości fali, takiego jak 6 33 nanometrów, aby uchwycić te kanały. Następnie określ odpowiednią moc lasera i wykryj czułość na odbicie i odbiór sygnału oraz transmitancję, a następnie powtórz tę samą serię zbierania wokół wszczepionego urządzenia.

Na koniec wyeksportuj dane do późniejszego przetwarzania, kwantyfikacji i analizy. Obrazowanie po obu stronach szkiełka może pozwolić na ocenę granicy faz wokół urządzenia, jak pokazano tutaj, gdzie mikroglej wzdłuż krzemowego podłoża MEA jest widoczny z jednej strony, a mikroglej wzdłuż miejsc elektrod i śladów jest widoczny po drugiej stronie. Po zobrazowaniu zamontowanej tkanki za pomocą etapu translacji XY, można uzyskać przegląd etykiet fluorescencyjnych na całym wycinku tkanki w żądanej rozdzielczości.

Tutaj jądra komórkowe barwione haczykami 3, 3, 3 4 2 i monocyty mikrogleju znakowane 3 2 9. Jeden z nich był jednocześnie wyświetlany na różnych kanałach. Zebrano również światło transmisyjne i współczynnik odbicia, pokazując lokalizację czterotygodniowego implantu w odniesieniu do haczyków i danych IVA one, nakładki wszystkich kanałów, ale transmisja jest pokazana tutaj.

Szczegółowe badanie morfologicznie zachowanej granicy faz tkankowych wokół wszczepionych mikrourządzeń można pobrać w dużym powiększeniu w celu analizy lokalnej odpowiedzi tkankowej, odbicie i przepuszczalność pozwalają na lokalizację urządzenia, podczas gdy fluorescencyjne przeciwciała lub znaczniki chemiczne umożliwiają szczegółowe obrazowanie składników tkanki wzdłuż nienaruszonego interfejsu tkankowego. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby naprawdę poświęcić trochę czasu na staranne oddzielenie wszczepionych urządzeń przez nasadkę na głowę i zaplanować, że ten krok zajmie ponad 30 minut. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbierać i przetwarzać wycinki mózgu zawierające wszczepione urządzenia.

Powinieneś również być w stanie oznaczyć i zebrać dane histologiczne opisujące neurobiologię otaczającą te urządzenia.