Wykorzystanie ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym do określenia wszczepienia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu przeszczepu mysiego szpiku kostnego

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie techniki opartej na PCR w celu ilościowego określenia wszczepienia komórek dawcy w konkurencyjnym mysim modelu przeszczepu szpiku kostnego, co osiąga się poprzez pierwsze wykonanie przeszczepu szpiku kostnego u samic myszy biorców przy użyciu męskich komórek dawcy. Następnie od myszy biorców pobiera się krew obwodową w różnych punktach czasowych i izoluje genomowe DNA. Próbki przygotowuje się dla krzywej standardowej.

Wreszcie, PCR w czasie rzeczywistym jest przeprowadzany z próbkami standardowymi i próbkami testowymi. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują wszczepienie męskich komórek pochodzących od dawcy u samic myszy biorców poprzez obliczenia w stosunku do standardowej krzywej ze znanym procentem męskiego i żeńskiego DNA. Męską przewagą tej techniki nad istniejącą metodą, taką jak metoda oparta na cytometrii przepływowej, jest to, że jest bardziej czuła, bardziej ekonomiczna, a próbki mogą być przechowywane przez długi czas.

Co najważniejsze, nasza technika jest najbardziej niezależna od sznurka i może być stosowana do dowolnego tła genomowego myszy, takiego jak dobrze zdefiniowany marker powierzchni komórki, aby odróżnić komórkę dawcy od komórek biorcy Po eutanazji FVB nj, samce dawców i samice myszy pod kapturem z przepływem laminarnym używają małych nożyczek i kleszczy, aby wyciąć kości udowe i piszczelowe i umieścić je w 60-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym sześć mililitrów lodu RPMI 1640 z 5% inaktywowanym ciepłem. FBS używa chusteczki Kim, aby usunąć mięśnie i inne tkanki i odciąć oba końce każdego trzonu kostnego w naczyniu. Następnie podłącz koniec kości do igły o rozmiarze 23 przymocowanej do strzykawki o pojemności trzech cm3 wypełnionej RPMI 1640 z 5% inaktywowanym termicznie FBS i wypłucz szpik.

Użyj tej samej igły do dezagregacji tkanki szpiku kostnego przez wielokrotne aspiracje. Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i wiruj ją przez pięć minut w temperaturze 400 G. Po usunięciu supernatu ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze temperatury pokojowej, lizie czerwonych krwinek, buforze i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut przed dodaniem pięciu do 10 mililitrów RPMI 1640 z 5% inaktywowanym ciepłem FBS przepuść komórki przez sitko do komórek i zbierz przepływ do nowego rura. Po odwirowaniu komórek przez pięć minut w temperaturze 400 G i usunięciu supernatantu, w osadku powinien nie być czerwonego koloru wskazującego na pełne usunięcie czerwonych krwinek ponownie zawieszonych w 10 mililitrach RPMI 1640 z 5% inaktywowanym ciepłem FBS po delikatnym wirowaniu, dodać małą porcję do hemocytometru i policzyć komórki.

Oblicz objętość komórek potrzebną do zmieszania się z konkurencyjnymi komórkami żeńskimi w stosunku pięć do dwóch do przeszczepu szpiku kostnego. Ostatnim krokiem w celu przygotowania komórek do wstrzyknięcia jest wymieszanie komórek dawcy i komórek konkurencyjnych, osadzenie komórek przemytych PBS i ponowne zamieszanie w PBS w końcowym stężeniu pięć razy 10 do szóstej na mililitr komórek dawcy i dwa razy 10 do szóstej na mililitr dla komórek konkurencyjnych, cztery do sześciu godzin przed przeszczepem szpiku kostnego. Napromienij samice myszy biorcy promieniowaniem gamma cezu 1 37 w pojedynczej dawce 11 grejów.

Umieść napromieniowane samice myszy w unieruchomieniu myszy i wstrzyknij mieszane komórki dawcy i konkurenta przez żyłę ogonową w całkowitej objętości 0,1 mililitra, tak aby każda mysz otrzymała pięć razy 10 do piątych komórek dawcy i dwa razy 10 do piątych konkurencyjnych komórek szpiku kostnego w celu pobrania próbek krwi. Po znieczuleniu myszy zbierają około 50 mikrolitrów krwi do probówek pokrytych EDTA poprzez krwawienie zaoczodołowe. Zbierz również próbki od samców i samic myszy w tym samym wieku.

Obok wyizoluj genomowe DNA od badanych myszy i myszy. W przypadku krzywej wzorcowej dodaj około 200 mikrolitrów buforu do lizy RBC o temperaturze pokojowej do każdej próbki krwi i inkubuj przez pięć minut. Dodaj jeden mililitr PBS i odwiruj, aby usunąć większość zlizowanych erytrocytów.

Następnie użyj zestawu do ekstrakcji DNA krwi, aby wyizolować DNA przed podgrzaniem buforu elucian do 37 stopni Celsjusza. Aby zwiększyć wydajność, zmierz stężenie DNA w każdej próbce. Do dalszej analizy wykorzystuje się te z OD dwa stosunek 60 do dwóch 80 między 1,8 a 2,0.

Aby ustalić krzywą wzorcową, rozcieńczyć męskie i żeńskie DNA do stężenia czterech nanogramów na mikrolitr i przygotować mieszaninę DNA zgodnie z tymi wytycznymi. Ustaw płytkę reakcyjną PCR, mieszając odczynnik cyber green super mix z pokazanymi tutaj starterami i genomowym DNA. Każda 20 mikrolitrów reakcji zawiera 400 nanomolowców każdego startera i pięć mikrolitrów genomowego DNA komórek krwi przebiega w trzech egzemplarzach.

Przeprowadź PCR zgodnie z warunkami znajdującymi się w protokole tekstowym i uzyskaj próg cyklu lub wartości CT. Obliczyć delta CT razy ilość CT do potęgi ZY jeden minus CT do potęgi BCL dwa i ZY jeden poziom wyrażenia lub dwa do potęgi minus delta CT wygenerować krzywe standardowe, wykreślając średnią z trzykrotności dwóch do potęgi wartości delta CT do znanego procentu męskiego DNA w mieszaninie z pokazanym dopasowaniem regresji liniowej. Oto przykłady krzywych standardowych wykreślonych ze średnimi wartościami od dwóch do potęgi delta CT w stosunku do procentów męskiego DNA.

Wykres ten obejmuje określoną temperaturę topnienia dla amplikonów BCL dwa i ZFY one, zlokalizowanych odpowiednio na poziomie 78,5 i 88,5 stopni Celsjusza. BCL dwa jest używany jako gen referencyjny do normalizacji całkowitej ilości załadowanego DNA w każdej reakcji PCR. BCL dwie krzywe amplifikacji dla każdej próbki wzorcowej łączą się ze sobą niezależnie od stężenia męskiego DNA, wskazując równe ilości załadowanego DNA.

Jednak krzywe amplifikacji ZFY one migrowały w lewo wraz ze wzrostem ilości męskiego DNA w próbce hematopoetycznych komórek macierzystych od myszy PIM TKO mają defekty w odtwarzaniu śmiertelnie napromieniowanych myszy i zgodnie z oczekiwaniami myszy biorców przeszczepione komórkami PIM TKO miały znacznie niższy odsetek komórek męskich w porównaniu do myszy przeszczepionych komórkami typu dzikiego. Aby zwalidować naszą metodę, przetestowaliśmy wszczepienie komórek dawcy płci męskiej u przeszczepionych samic myszy, otrzymujących komórki szpiku kostnego od myszy typu dzikiego w porównaniu z myszami z potrójnym nokautem PIM lub TKO w różnych punktach czasowych po przeszczepie, zarówno krwi obwodowej po sześciu tygodniach, jak i próbek szpiku kostnego po 16 tygodniach. Zostały przeanalizowane po obejrzeniu tego filmu.

Powinieneś dobrze wiedzieć, jak używać metody opartej na PCR do ilościowego określania wszczepienia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu przeszczepu szpiku kostnego w morzu.