Wprowadzenie do czytnika mikropłytek

Czytnik mikropłytek to powszechnie stosowany instrument, który umożliwia jednoczesny pomiar wielu próbek, tak jakby w tym samym czasie przeprowadzano wiele miniaturowych eksperymentów.

Urządzenie to jest używane wraz z płytkami wielodołkowymi, takimi jak płytka 96-dołkowa.

Niezależnie od rodzaju eksperymentu wykonywanego za pomocą czytnika mikropłytek, do wyznaczenia wartości próbek badawczych, a także kontroli pozytywnych i negatywnych, często stosuje się krzywe wzorcowe.

Czytniki mikropłytek występują w różnych kształtach, rozmiarach i konfiguracjach. Wiele czytników mikropłytek posiada funkcje multimodalne, co pozwala na przeprowadzanie wielu różnych analiz. Tryby te obejmują możliwość wykonywania różnych typów pomiarów, takich jak pomiary absorpcyjne, fluorescencyjne i luminescencyjne.

Płytki wielodołkowe są integralnymi elementami czytnika mikropłytek i służą do przechowywania próbek mierzone przez urządzenie. Płytki te mogą mieć różne rozmiary, różne rodzaje dna dołków oraz różną liczbę dołków. Rodzaj zastosowanej płytki zależy od przeprowadzanego badania.

Taca załadowcza służy do wprowadzania płytki 96-dołkowej do urządzenia.

Do obsługi czytnika płytek oraz kontrolowania jego ustawień i parametrów, takich jak długość fali i tryb pracy, zazwyczaj wykorzystuje się interfejs komputerowy. Oprogramowanie czytnika płytek posiada graficzny interfejs użytkownika reprezentujący płytkę, który umożliwia zaznaczenie dołków wypełnionych próbkami.

Do napełniania płytek wielodołkowych często stosuje się pipety wielokanałowe. Zbiorniki służą do przechowywania roztworów dla pipety wielokanałowej.

Dołki można czasami napełniać przy użyciu standardowej pipety jednokanałowej.

Próbki i standardy nanosi się w powtórzeniach podwójnych lub potrójnych, aby uwzględnić ewentualne błędy pipetowania. Tutaj przedstawiono płytkę napełnioną w potrójnych powtórzeniach.

Krzywa standardowa wykorzystuje próbki o znanych stężeniach, które dają różne wartości absorbancji. Dane te są następnie wykorzystywane do stworzenia wykresu, na którym wyznacza się linię trendu.

Próba ślepa służy do określenia części pomiaru, która nie jest istotna eksperymentalnie i wynika z buforów, w których rozcieńczono próbkę, lub odczynników, na które próbka została wystawiona. Wartości uzyskane z tych pomiarów nazywa się „tłem”. Próba ślepa nie zawiera żadnej próbki.

Kontrola pozytywna wskazuje, czy test przebiegł prawidłowo; powinna ona dać wynik dodatni. Kontrola negatywna to zmienna kontrolna, w której nie oczekuje się zaobserwowania żadnego pomiaru/efektu. Nie powinna ona dawać żadnego wyniku.

Po przygotowaniu płytki można przystąpić do naniesienia próbek. Aby zapobiec pomiarowi niewłaściwych próbek lub błędnemu załadowaniu płytki, kluczowe jest jej prawidłowe zorientowanie w tacy załadunkowej. Należy zachować ostrożność podczas umieszczania próbek w tacy, aby nie wtłaczać tacy siłą do urządzenia i nie przytrzasnąć palców wewnątrz instrumentu.

Po załadowaniu tacy, w oprogramowaniu ustawia się parametry, takie jak tryb, długość fali i kolejność odczytu dołków, przed rozpoczęciem pomiaru płytki.

Po ustawieniu parametrów następuje odczyt płytki, a czytnik generuje zestaw wartości w oprogramowaniu.

Po odczycie płytki należy wykorzystać średnią wartość z prób ślepych, aby odjąć tło od wszystkich próbek, w tym z krzywej standardowej.

Po odczycie znane wartości stężeń standardów nanosi się na wykres w zestawieniu z ich odpowiednimi wartościami zmierzonymi, w tym przypadku absorbancją.

Po naniesieniu wartości linię trendu można obliczyć za pomocą regresji liniowej. Można to łatwo zrobić w programie do arkuszy kalkulacyjnych.

Współczynnik determinacji, będący statystyczną miarą tego, jak dobrze linia przewiduje rzeczywiste punkty danych, powinien mieścić się w przedziale 0,90–0,99, przy czym wartość 0,99 jest uznawana za najlepszą i oznacza, że linia idealnie pasuje do danych.

Korzystając z linii trendu, możemy obliczyć wartości stężeń próbek eksperymentalnych lub kontrolnych w każdym dołku, podstawiając wartość absorbancji za Y, a następnie rozwiązując równanie dla X. Wartości stężeń można również oszacować, prowadząc linię od wartości absorbancji na osi Y do linii trendu, a następnie w dół do osi X.

Wiele rodzajów czytników mikropłytek mierzy absorbancję, która jest definiowana jako logarytmiczny stosunek światła padającego na obiekt do światła przechodzącego przez ten obiekt.

Test Bradforda jest przykładem analizy na czytniku mikropłytek opartej na absorbancji, w której próbki białek nanosi się na płytkę z odczynnikiem „Bradford”. Związek ten wiąże się z białkami w próbce, co powoduje zmianę jego absorbancji.

W analizach fluorescencyjnych fluorochrom jest aktywowany przez światło o określonej długości fali, co prowadzi do wzbudzenia fluorochromu, który emituje światło o innej długości fali.

Podczas pracy z odczynnikami światłoczułymi należy pamiętać o ich zasłanianiu, aby zapobiec fotoblaknięciu i zniweczeniu eksperymentu.

Analizy luminescencyjne emitują światło w wyniku reakcji chemicznej i często wykorzystują lucyferazę. Lucyferaza pochodzi z wielu źródeł, takich jak świetliki. W reakcji lucyferazy światło jest emitowane, gdy lucyferaza wchodzi w kontakt z tlenem, ATP i magnezem w serii reakcji.

Analizy luminescencyjne mają wiele różnych zastosowań. Przykładem takiego zastosowania jest pomiar produkcji i detekcja reaktywnych form tlenu w nowotworach.

Inne zastosowania wykorzystujące czytniki mikropłytek obejmują analizy wysokoprzepustowe z użyciem płytek 384- i 1536-dołkowych. W takich analizach płytki są ładowane przez robota. Nie, nie takiego rodzaju robota. Chodzi o programowalnego robota, który automatyzuje niezwykle precyzyjną obsługę próbek.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do czytnika mikropłytek. W tym filmie pokazaliśmy, czym jest czytnik mikropłytek(A), jak się go wykorzystuje(B), jak obsługiwać to urządzenie(C), jak interpretować dane z czytnika mikropłytek oraz przedstawiliśmy niektóre zastosowania czytnika mikropłytek(D). Dziękujemy za uwagę.